При введении ретровирусных векторов

в эти клетки образуются вирионы, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клетки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой системы, так же как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной линии нормальным ретровирусом и получения на этой основе компетентного по репликации вектора. Для предотвращения этого необходимо регулярное тестирование «пакующей» линии клеток. Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточными РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последствия такого события могут быть выявлены в экспериментах на животных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных векторов являются:

¦ их способность переносить генетический материал только в про-лиферирующие клетки;

¦ способность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;

¦ возможность спонтанной активации онкогена;

¦ небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тыс. п.о.;

¦ сравнительно низкий титр (106-107 на 1 мл) рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции;

¦ необходимость конструирования соответствующих «пакующих» клонов клеток.

Аденовирусные векторы. В отличие от ретровирусов аденовирусы активно инфицируют неделящиеся клетки, обладают большей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка более 8 тыс. п.о.), имеют высокий титр - 10" на 1 мл, однако не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки [Hodgson C.P., 1995]. Использование их перспективно для генокоррекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других органов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при доставке аэрозольным способом, что было использовано в первых клинических испытаниях по генотерапии муко-висцидоза [Crystal R.G. et al., 1994]. В аденовирусные векторы также инсертируют маркерные гены - neo, CAT или р-галактозидазный ген (р-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуцированные клетки. Для конструирования векторов используют дефектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (Ela, Elb) - так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколения, в которых, помимо генов Ela и Elb, удаляют и регуля-торный ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в присутствии клеток-помощников (например, в культуре клеток почек человека).

Рекомбинантные вирусы

 

Конструирование векторов на базе вирусов представляет собой наиболее интересный и перспективный раздел генотерапии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективного проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов - и система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматривать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для клеток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции клеток человека in vitro и in vivo, который необходим для проявления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные эксперименты на животных и первые клинические испытания утвержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологических процессов, связанных с использованием вирусных частиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоас-социированные вирусы, вирус герпеса, вирус СПИДа (HIV), вирус ветряной оспы и некоторые другие [Anderson W.F., 1992; Culver K.W., 1994; Lowenstein P.R., 1994; Kay M.A., Woo S.L.C., 1994; Hodgson СР., 1995]. Учитывая большую практическую значимость этих векторов, рассмотрим их более подробно.

Ретровирусные векторы. Генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто используются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный ретровирусный вектор -вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV). По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. Для безопасности ретровирусные последовательности модифицируют таким образом, что в инфицированных ими клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последовательностей вируса. Репликация вирусных векторов может происходить только в специальных «пакующих» клетках, в геном которых встроены все гены, производящие вирусные белки.

Белки-мишени (иммунолипосомы)

Особенно перспективными в последнее время представляются комплексы, в которых липосомы конъюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) либо с белками-лигандами (см. выше). Эти конструкции обеспечивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клетки-мишени. Подобная схема была успешно апробирована для переноса гена сывороточного альбумина человека в гепатоциты линейных крыс Nagase с наследственной ди-сальбуминемией. Доказаны присутствие и экспрессия введенного таким образом гена человека в клетках печени крыс. Аналогичные результаты получены в опытах на линейных кроликах Watanabe, дефектных по рецепторам липопротеинов низкой плотности - LDL. Эти животные моделируют одно из наиболее частых моногенных заболеваний человека -семейную гиперхолестеринемию. При внутривенной инъекции кроликам липидного асиалогликопротеинового комплекса с плазмидной ДНК, несущей нормальный LDL-ген, уровень холестерина в крови животных устойчиво понижался.

Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем на основе липосом является их низкая иммунореактивность. Они лишены и многих других недостатков, свойственных вирусным векторным системам. Вместе с тем до сих пор не решена проблема низкой частоты трансформации клеток при липосомном переносе. Это обстоятельство существенно ограничивает применение липосом в генной терапии [Crystal R.G., 1995].

Тем не менее в настоящее время рецептор-опосредованный вариант передачи генетической информации в клетки эукариот с использованием в качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков, а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в одной системе совместить преимущества физико-химических методов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет один из наиболее перспективных и быстро развивающихся направлений в трансфекции эука-риотических клеток.

Лнпосомный метод трансфекции

Направленный перенос генов во многие типы клеток, содержащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплекси-ровании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существенно облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание ее в ядро. Идеальными белковыми лигандами для специфических клеточных рецепторов могут служить моноклснальные антитела или их фрагменты, направленные против тех элементов рецепторов, которые находятся на наружной поверхности клеточной мембраны. Подобная система разработана для рецептор-опосредованного генного переноса в эпителиальные клетки. Она основана на использовании противосекреторных SCFab-фрагментов антител для полимерного им-муноглобулинового рецептора plgR. Этот рецептор транспортирует IgA и IgM в респираторные эпителиальные клетки, связывая иммуноглобулины и интернализируя их путем эндоцитоза. Показано, что в системе in vitro частота трансфекции эпителиальных клеток при использовании 8СРаЬ-поли-Ь-лизин-ДНК комплекса такая же, как и при введении экзогенной ДНК посредством трансферринового рецептора. Аналогичные подходы могут быть применены для введения генов и в другие типы клеток.

Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от деградации лизосомальными ферментами достигаются при использовании в качестве векторов липосом - липидных пузырьков, обладающих выраженными фузогенными свойствами - способностью сливаться с клеточными мембранами. Особенно перспективны в этом отношении липо-сомы, полученные на основе катионных липидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких пузырьков обеспечивает их активное слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и, соответственно, не подвергаясь действию лизосомных гидролаз. Очень эффективный перенос высокоочищенных ДНК- или РНК-последовательностей в соматические, особенно в мышечные ткани, может быть осуществлен с помощью препаратов липофектина или липофектамина [Caplen N.J. et al., 1995]. Гораздо более высокая частота трансфекции по сравнению с липосом-опосредованным переносом получена в экспериментах на культурах клеток при использовании ДНК-липидного комплекса с циклическим амфипатическим пептидом грамицидином S.

Специфические белки

В качестве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалоглюкопротеин, конъюгированный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействующие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию генной конструкции на специфических клетках, т. е. адресную доставку чужеродной ДНК в клетки определенного типа (например, асиалоглюкопротеин - в клетки печени, трансферрин и эритропоэтин - в клетки крови и т. д.). Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компакти-зующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизину, DEAE-декстрану и др.).

Важными компонентами системы являются аденовирус или его N-концевой фрагмент, выступающие в качестве эффективных фузоген-ных агентов, обеспечивающих выход экзогенной ДНК из эндосом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адресная доставка и эффективная защита от лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конструкций, их несомненную перспективность для генной терапии in vivo [Hodgson СР., 1995].

Мы уже упоминали о возможности сочетания векторного и физико-химического подхода при конструировании систем для переноса генов в клетки человека. Одна из таких систем основана на использовании фи-ламентного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фага, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсертируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полилизиновые остатки в составе слитого белка связываются с плазмидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательность ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий (обеспечивающий проникновение) фага внутрь клетки. С этой целью были апробированы гены белков патогенных бактерий, поражающих кишечный эпителий -интерналин и инвазии, а также последовательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабельного района моноклональных антител АЫ1. Было показано, что во всех трех случаях достигается адресная доставка и интернализация фага в клетки-мишени, т. е. система успешно функционирует.

Методы физического переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот

 

Уместно заметить, что чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот благодаря наличию на наружных клеточных мембранах белков, специфически связывающих ДНК. Путем эндоци-тоза (впячивания внутрь клеточной мембраны) чужеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом, где обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из эндосом, попадает в ядро и если не разрушается эндогенными нуклеазами, то может быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случается достаточно редко. Известное исключение составляют мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК долго (до 1 года) может сохраняться и даже экспрес-сироваться в миофибриллах [Hansen E. et al., 1991].

Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть достигнута путем микроинъекции (метода, применяемого сегодня почти исключительно для создания трансгенных животных путем введения экзогенной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки - см. главу 8), при помощи электропорации (кратковременного воздействия сильным электрическим полем), путем перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, конъюги-рованными с чужеродными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбардировки). Эти методы доставки применимы, главным образом, для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки, который при наличии специального генного «ружья» с успехом применяется и in vivo [Yang N.S. et al., 1990].

Для повышения эффективности переноса обычно используют системы доставки (соединения или группы соединений), взаимодействующие с ДНК с образованием компактных структур, облегчающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от действия нуклеаз [Власова И.Е. и др., 1994]. Самой простой системой доставки является система кальций-фосфатиой копреципитации, широко применяемая для трансфекции клеток in vitro. Более сложный и многообещающий вариант трансфекции представляет собой рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание достаточно сложной, обычно трехкомпонентной, конструкции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус