Консультативно-методический совет медико-генетической службы Минздрава РФ

Учитывая некоторые исторические особенности становления -пренатальнои диагностики в нашей стране [Баранов В. С, 1987; 1990; 1994], относительно высокую стоимость молекулярных исследований, кажется вполне оправданным наличие определенной комплементарности в распределении диагностируемых нозологии по центрам. Так, за нашим центром в Санкт-Петербурге, первым в стране начавшим использовать молекулярные методы в пренатальнои диагностике моногенных болезней, закрепилась молекулярная диагностика муковисцидоза, мио-дистрофии Дюшенна, гемофилии А и В, синдрома ломкой Х-хромосомы, фенилкетонурии, миотонической дистрофии. В лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (Москва ) успешно диагностируются спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана, адреногенитальный синдром, болезнь Вильсона-Коновалова, атаксия Фридрейха, синдром Аль-порта, некоторые формы агаммаглобулинемии, а также болезнь Шарко-Мари-Тус.

Помимо молекулярной диагностики, ФМГЦ (г. Томск) занимается разработкой и апробацией новых методов диагностики, лечения и реабилитации больных с наследственной патологией, подготовкой и повышением квалификации специалистов других медико-генетических учреждений, контролем за ведением региональных регистров семей с наследственными болезнями; созданием банка ДНК-данных по нозологи-ям, разработкой научно-практических программ.

Высшим звеном медико-генетической службы страны является Консультативно-методический совет медико-генетической службы Минздрава РФ, который состоит из ведущих ученых и практических работников по медицинской генетике. В задачу совета, состоящего из 18 человек, входят методическое руководство и оказание практической помощи медико-генетической службе страны; разработка планов централизованной закупки и распределения по центрам необходимого оборудования, реактивов, лекарств и лечебного питания, диагностикумов для проведения скринирующих программ; планы подготовки кадров; практическая помощь в создании компьютеризированных регистров; контроль за качеством и эффективностью работы всех уровней медико-генетической службы.

Медико-генетические консультации

Региональный уровень представлен медико-генетическими консультациями (центрами), которые формируются уже как самостоятельные учреждения или в составе лечебно-профилактичесих учреждений (ЛПУ) и выполняют такие важные функции, как:

¦ медико-генетическое консультирование с использованием специальных лабораторных методов для уточнения диагноза;

¦ скрининг беременных путем ультразвукового обследования и анализа сывороточных маркерных белков (ос-фетопротеина и хорио-нального гонадотропина) для выявления женщин, имеющих повышенный риск рождения детей с грубыми аномалиями центральной нервной системы и хромосомными болезнями;

¦ пренатальную цитогенетическую диагностику хромосомных болезней плода у женщин старшей возрастной группы (39 лет и более);

¦ селективный скрининг семей на наследственные метаболические болезни;

¦ массовый скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз;

¦ ведение территориального регистра семей и больных с наследственной и врожденной патологией.

На базе научно-исследовательских институтов и областных МГК могут создаваться межрегиональные МГК, выполняющие помимо вышеперечисленных функций дополнительные виды специализированной диагностики сложных случаев, а также обеспечивающих лечение больных с фенилкетонурией. В стране насчитывается 16 региональных и межрегиональных МГЦ.

Наконец, приказом Минздрава РФ на базе ведущих НИИ России созданы шесть Федеральных медико-генетических центров: по одному в Санкт-Петербурге и Томске и четыре - в Москве. Существенно, что в особенно сложных случаях дифференциальная диагностика наследственной и врожденной патологии проводится с использованием не только цитогенетических и биохимических, но и молекулярных методов. Таким образом, практически только на федеральном уровне становится доступной молекулярная диагностика наследственных болезней как в пост-натальном периоде, т. е. у больных, так и на пренатальных стадиях развития, т. е. у ппода. Реально ДНК-диагностика моногенных болезней проводится только в двух федеральных центрах: в Санкт-Петербурге на базе лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. ДО. Отга РАМН и в Москве - в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. Первые попытки молекулярной диагностики отдельных нозологии предприняты в Институте медицинской генетики РАМН в ФМГЦ г. Томска. Ряд специализированных НИИ России также проводят молекулярную диагностику отдельных наследственных заболеваний

ОРГАНИЗАЦИЯ СЛУЖБЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ В РОССИИ

 

В предыдущей главе мы уже рассмотрели основные моногенные наследственные болезни, по которым в России возможна молекулярная диагностика, а также указали те основные диагностические центры страны, где она проводится. В заключительной главе нам представляется целесообразным рассмотреть некоторые аспекты общей структуры медико-генетической службы (МТС) России, обратив основное внимание на службу пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней.

Известно, что эффективная профилактика наследственных болезней может быть достигнута при рациональной организации и использовании пяти основных подходов:

¦ медико-генетического консультирования;

¦ пренатальной диагностики;

¦ массового скринирования новорожденных на наследственные болезни;

¦ диспансеризации, включающей проспективное консультирование семей высокого риска и активное выявление гетерозиготных носителей мутантных генов;

¦ контроль за мутагенными факторами окружающей среды [Козлова СИ., 1987].

Структура организации МГС России, принципы взаимоотношения ее подразделений, их конкретные функции, кадровое и аппаратурное обеспечение и регламентация работы персонала подробно изложены в Приказе Минздрава РФ № 316 от 30.12.1993 г. Согласно данному приказу, МГС построена по территориальному принципу и включает три основных уровня: районный (городской), региональный (межрегиональный) и федеральный.

Районный (городской) уровень представлен консультативными кабинетами по медицинской генетике, число которых уже в 1990 г. достигало 115 [Козлова СИ., 1990J. В обязанности врача-генетика или врача, прошедшего специализацию по медицинской генетике, входят следующие обязанности: выявление семей, отягощенных наследственной патологией; их направление для уточнения диагноза в региональный центр; диспансерное наблюдение за лицами с выявленной патологией.

Атаксия Фридрейха

Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1:22000 - 25000 ) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9ql3-q21) и физических картах ДНК-маркеров. Наиболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5 (зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген АФ. Определено положение гена АФ по отношению к другим фланкирующим молекулярным маркерам [Fujita R. et al., 1991; Wilkes D. et al., 1991]. В настоящее время известно, по крайней мере, 5 таких ДНК-маркеров: дистальные - GS4, МСТ-112, GS2 и проксимальные - микро-сателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 тыс. п.о.) и MLS1 (на расстоянии 150 тыс. п.о.). Изучены особенности аллельного полиморфизма этих систем для различных популяций Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих микросателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывает их весьма близкое расположение на генетической карте по отношению к мутант-ному гену АФ [Pianese L. et al., 1994].

Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами. Проводится ПДРФ-анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты либо ПЦР-анализ полиморфизма проксимальных по отношению к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.

Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследственные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя главным образом из того, насколько они изучены с молекулярно-генетических позиций, их актуальности для пренатальной диагностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так, что именно такие заболевания, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурйя, т. е. социально наиболее значимые, раньше других генных болезней стали предметом детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987; Баранов B.C., 1991; 1994; BaranovV.S., 1993].

Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объектами молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные. болезни как гиперхолестеринемия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1-антитрипсина, митохондриальные болезни. Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ведутся исследования по генотерапии. Мы не касались также работ, проводимых главным образом в возглавляемой профессором Е.И. Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных заболеваний, таких как диабет, гипертония, ишемия сердца.

Непосредственная близость от теломерного конца гена SMN

В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора запрограммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein - NAIP). При тяжелых клинических формах СМА (тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.

Согласно гипотезе авторов, СМА возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно - делений) в гене SMN, при этом различия между формами СМА определяются двумя основными факторами: во-первых, числом копий гена CBCD541 (двумя - в случае типа I и четырьмя, возникающими вследствие конверсии между SMN и cBCD541, - в случае типа III), во-вторых, наличием или отсутствием гена NAIP. Среди всех обследованных СМА-больных не обнаружены случаи одновременной делеции обоих гомологичных генов - SMN (tBCD541) и CBCD541, что указывает, по мнению авторов, на то, что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.

Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточнения, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молекулярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью проводится амплификация экзона 7, который отсутствует у подавляющего большинства бол*>ных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) дифференцируют от мутантного варианта (ген CBCD541) с помощью SSCP-анализа. При необходимости возможна косвенная диагностика - ПЦР-анализ динуклеотидных (СА) повторов ДНК-локусов D5S125, D5S112, D5S127, ПДРФ-анализ с фланкирующими ДНК-зондами MU, 105-153RA, 153-6741GT.

Спинальная мышечная атрофия

 

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессивное заболевание - характеризуется поражением моторных нейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища. Это - второе после муковис-цидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1:6000 новорожденных).

СМА подразделяется на три клинические формы:

¦ тип I - острая форма (болезнь Верднига - Гоффмана), проявляется в первые 6 мес. жизни и приводит к смерти уже в первые два года;

¦ тип II - средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять, но обычно живут более 4 лет;

¦ тип III - ювенильная форма (болезнь Кугельберга - Веландера) -прогрессирующая мышечная слабость после 2 лет.

Все три формы представляют собой аллельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5ql3) и идентифицированного методом позиционного клонирования (см. главу 3) в 1995 г. [Lefebvre S. et al., 1995]. В этой, пока единственной, работе показано, что ген SMN размером всего 20000 п.о. состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярной массой 32 кД.

Ген дуплицирован. Его копия (возможно, вариант псевдогена) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-точечных мутаций, позволяющих отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследования методом SSCP анализа (см. главу 4). Ген назван CBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т. е. гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но, в отличие от гена SMN, его кДНК подвергается альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7. Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229), его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5,6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся 3 больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отметить, что центромерная копия гена обнаружена у 95,5% больных, тогда как отсутствует она только у 4,4% пациентов.

Адреиогеиитальиый синдром

 

Адреногенитальный синдром - (врожденный дефицит 21 -гидрокси-лазы) - достаточно распространенное аутосомно-рецессивное заболевание. Частота «классических» форм -1:10000 новорожденных, «неклассической» - около 1% в популяции. В зависимости от характера нарушения функции гена и, соответственно, клинических проявлений «классическая» форма подразделяется на два варианта: летальная соль-теряющая форма и нелетальная - вирилизирующая форма, связанная с избытком андрогенов [Morel Y., MillerW.L., 1991].

В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных 21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псевдоген -CYP21A, неактивный вследствие делеции в 3-м экзоне, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс-мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фактор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину 3,4 тыс. п.о. и отличаются только по 87 нук-леотидам. Высокая степень гомологии и тандемное расположение указывают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить, что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы (называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитающих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого скота функционально активны оба гена.

Белок - 21-гидроксилаза (Р450с21 - микросомальный цитохром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в 11-дезоксикор-тизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон. В случае нарушения первого процесса возникает дефицит глюкокортикоидов, и прежде всего кортизола, что, в свою очередь, стимулирует синтез АКТГ и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогестерон ведет к дефициту аль-достерона, что, в свою очередь, нарушает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (сольтеряющая форма).

Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК-последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген) либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсии - 20%, и примерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечественным данным, в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС на долю конверсии приходится более 20% мутантных хромосом, на долю делеций - около 10% [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA А- и HLA В-генов, а также аллелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК-диагностика АГС основана на амплификации с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами НаеШ или Rsal и анализе полученных фрагментов после электрофореза [Evgrafov O.V. etal., 1995].

Болезнь Вильсоиа-Коиовалова

 

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медьсодержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участвующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК [Сох D.W. et al., 1972]. При редкой атипичной форме, предположительно германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и ювенильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравнительно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной Европе, и ведущими в этиологии заболевания являются печеночные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с поздним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных.

Ген БВК, идентифицированный в 1993 г. независимо сразу в двух лабораториях США, представляет собой медь-транспортирующую АТФазу Р типа с 6 металл-связывающими районами [Bull P.C. et al., 1993; Petruchin К. et al., 1993; Tanzi R.E. et al., 1993; Thomas et al., 1995]. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее идентифицированным геном АТФазы (АТР7А), мутантным при болезни Менкеса. По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в кодирующей области гена АТР7В, что доказывало его идентичность гену БВК [Petruchin К. et al., 1993]. Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена (6, 7, 8, 12 и 13).

Кодируемый АТР7В-геном белок содержит несколько мембранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилиро-вания и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сайта. В мозге, печени, почках и лимфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвестны. В гене АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры, а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс-мутации, 15 - миссенс-мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации Hisl070Gln и Glyl267Lys, зарегистрированные в 28% и 10% всех мутантных хромосом, соответственно [Thomas G.R. et al., 1995].

В заключение данного раздела представляется целесообразным кратко рассмотреть другие достаточно частые моногенные заболевания, для которых показана и проводится молекулярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других медико-генетических центрах России, и прежде всего, в Лаборатории молекулярной диагностики Института клинической генетики РАМН (Москва) [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек

Описаны редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации Х-хромосомы, не содержащей мутации [Ogasawara N. et al., 1989]. Однако у 3 женщин - облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене - селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фибробластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в Х-хромосоме, что и приводит к селекции клона клеток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT) Х-хро-мосомой [Marcus S. et al., 1993].

Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на проведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации, SSCP-анализе одноцепочеч-ных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см. главу 6). Косвенная диагностика предусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи полиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 -30HflStl4/TaqI).

Как мы уже отмечали, первая трансгенная животная модель наследственного заболевания человека, сконструированная путем направленного переноса мутаций в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана [Hooper M. et al., 1987; Kuehn M.R. et al., 1987]. На этой модели впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяющих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще, синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения многих теоретических вопросов биологии и медицины [Seegmiller J.E., 1989; Boyd et al., 1993; Marcus et al., 1993]. Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT (или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клетки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегодняшний день отсутствуют

Синдром Леш-Нихаиа

Синдром Леш-Нихана - рецессивное, сцепленное с полом заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью гипоксантингуа-нинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровождающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы. Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов, контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессирует-ся во всех типах клеток с образованием мРНК размером 654 п.о. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и 6-тиогуанину и, таким образом, могут быть отобраны на соответствующих селективных средах. Гетерозиготные носители мутаций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию двух типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных луковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молекулах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.

В 15% хромосом у больных с синдромом Леш-Нихана ген HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, которые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибридизации [Jolly et al., 1983; Edwards et al., 1990; Rossiter et al., 1991; Sculley et al., 1992]. Синдром Леш-Нихана - одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена молекулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой модели впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонуклеазой А в местах негомологичного спаривания (метод расщепления рибонуклеазой А) (см. главу 6) [Gibbs R.A., Caskey СТ., 1987]. Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонуклеазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, половина которых - однонуклеотидные замены типа миссенс-, нонсенс-мутации и мутации в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных экзонов и микроделеции одного или нескольких нуклеотидов. В HPRT-гене практически отсутствуют мутации, домининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключением является нонсенс-мутация R170TER, которая составляет около 15% всех нуклеотидных замен [Gibbs R.A. et al., 1989]. Так же как и при гемофилиях, мутации гена HPRT чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хромосомах 3, 5 и 11 [Stout J.T., Caskey СТ., 1985].

Косвенная диагностика мутаций в РАН-гене

В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в РАН-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод nHP/StyI-диагностики самой частой в России (более 70%) мутации R408W [Иващенко Т.Э. и др., 1993; Ivaschenko Т.Е., Baranov V.S., 1993]. Диагностика других мажорных мутаций в РАН-гене осуществляется методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом однонитевого информационного полиморфизма (SSCP) (см. главу 4) [Барановская С.С. и др., 1995]. При первичном обследовании семьи чрезвычайно удобно использовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232, 245 и 385, сцепленные в кавказских популяциях с определенными ПДРФ-гашготипами, а значит, и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрикции, и поэтому их аллельное состояние может быть легко протипировано с помощью амплификации и рестрикции [Kalaydjieva L. et al., 1991]. При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная диагностика может быть проведена с помощью внутригенных полиморфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Mspl-полиморфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции [Wedemeyer et al., 1993]. В последнее время появились данные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобными для молекулярного маркирования мутантных аллелей [Goltsov A. A. et al., 1992].

Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии экспериментальной разработки

Неравновесие по сцеплению

Внутри РАН-гена локализованы более 10 полиморфных сайтов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим маркерам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в РАН-гене и гаплотипами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5 наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоциирована только с одним из более чем 70 гаплотипов по 8 рестрикционным полиморфизмам [Eisensmith R.C. et al., 1992]. Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в донорном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 [DiLella A.G. et al., 1986]. В то же время другая мутация в экзоне 12 - R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в частности, в Белоруссии и России и не найденная в Японии и Китае, связана с гаплотипом 2 [DiLella A.G. et al.,1987]. Мажорная в Европе мутация R158Q в 40% случаев сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Турции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к 9-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с «южными» гаплотипами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморфным сайтам рестрикции и мутаций в РАН-гене в разных популяциях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод, что большинство из них или даже все произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам, эти мутации возникли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако в ряде случаев распределение мутаций не может быть объяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие популяционные частоты специфических мутаций в РАН-гене связаны, по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с существованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН-мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторыми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), развивающимися при хранении зерна и других продуктов [Woolf L.I., 1986]. Предполагается, что беременные женщины, гетерозиготные по РАН-мутациям, имеют меньшую вероятность аборта, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно, высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть объяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующим росту таких грибов.

Фенилкетонурия

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным дефектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Европе один больной ребенок встречается в среднем среди 10-17 тыс. новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новорожденных [DiLella A.G. et al., 1986]. Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1:8-10 тыс. Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевременном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин, умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скринирующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенила-ланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фермент, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 52 кД, продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фенилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфе-нилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридин-редуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отличаются от классической ФКУ и не корригируются диетой, лишенной фенилаланина.

РАН-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2,4 тыс. п.о. [Guttler F., Woo S.L.C., 1986; DiLella A.G. et al., 1986; Cotton R.G.H., 1990]. Наиболее распространенный тип мутаций - одно-нуклеотидные замены (миссенс-, нонсенс-мутации и мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом трансци-зий в 22 обнаруженных в РАН-гене CpG-динуклеотидах. Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется небольшой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций [Scriver C.R. et al., 1989]. Так, наибольшее число миссенс-мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где расположено 5 CpG-дуплетов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район локализации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Вил-лебранда

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Вил-лебранда в значительной мере предопределяется правильностью предшествующей клинической и лабораторной диагностики и результатами медико-генетического консультирования, позволяющими достаточно четко определить характер наследования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно, а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижает эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере в некоторых популяциях (Финляндия, Швеция), обнаружены «горячие» точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда [Holmberg L. et al., 1993]. В популяциях России такие «горячие» точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся. Значительно более перспективной на современном этапе представляется непрямая диагностика. В промоторной части гена, в интронах 15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 идентифицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспективным для диагностики является полиморфизм интрона 40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплификация этой части интрона 40 с помощью ПЦР, рестрикция Alul с последующим электрофоретическим разделением позволяет идентифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма [Mercier В. et al., 1991]. Столь выраженный полиморфизм позволяют с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому (ген) и проследить ее передачу в потомстве.

Сведений о генокоррекции болезни Виллебранда в доступной литературе не обнаружено.

Замены аминокислот

Наибольшее число мутаций идентифицированы при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате трансцизий в CpG-динуклео-тидах [Cooney К.A. et al., 1991; Randi A.M. et al., 1991; Donner M. et al., 1992]. Мутации при болезни типа НА кластерированы в А2 домене, где предположительно локализован сайт протеолитического отщепления, в то время как при типе ИВ - в домене, обеспечивающем взаимодействие с тромбоцитарным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания ПВ локализована в сегменте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509-м и 695-м положениях. При форме заболевания Нормандского типа, мимикрирующей гемофилию А, фактор Виллебранда структурно и функционально нормален, за исключением того, что нарушено его взаимодействие с фактором VIII. У таких пациентов действительно идентифицируются миссенс-мутации, расположенные в области гена, кодирующей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIC [Mazurier С, 1992].

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания, при которой фактор VIIIR, как правило, отсутствует. Получены доказательства, что такие пациенты являются гомозиготами или компаундами по нонсенс-мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I [Zhang Z.P. et al., 1992]. При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникающих в результате деле-ции одного из 6 цитозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мутация была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон Виллебрандом в 1926 г. У некоторых членов этой родословной, как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) [Zhang Z.P. et al., 1993].

Болезнь Виллебранда

 

Болезнь Виллебранда - аутосомно-доминантное (при некоторых формах - рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору VIIIC свертывания крови (см. 10.4.3) и известного как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезируется клетками эндотелия, в которых специфическая VIIIR-мРНК составляет 0,3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 тыс. до 20 млн дальтон. Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосудов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах повреждения эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции синтеза и секреции фактора VIIIC и стабилизирует комплекс фактора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и III [Zimmerman T.S., Ruggeri Z.M., 1987]. При типе I снижена концентрация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено. Генетически эта форма заболевания подразделяется на рецессивные и доминантные варианты. Типы ПС и III - рецессивны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры (типы ПА и ПС) или в увеличении скорости их выведения из плазмы (тип ПВ).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. [ Lynch et al., 1985; Bonthorn et al., 1986; Mancuso D.J. et al., 1989; Cooney et al., 1991; Randi et al., 1991]. Величина интронов варьирует в огромных пределах (от 100 п.о. до 20 тыс п.о.). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субъединица VIIIR-фактора и З'-нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся последовательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный ТСТА-повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гена, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22ql 1—q 13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 тыс. п.о., соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-reHa [Mancuso D.J. et al., 1991]. Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс-мутации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Модель для выработки стратегии генетического консультирования

Гемофилия В была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных заболеваниях, обладающих выраженной мутационной гетерогенностью [Giannelli F. et al., 1992]. Основой такой стратегии является составление национальных баз данных молекулярных дефектов и специфических методов их диагностики. В частности, основываясь на подобной информации, авторы провели характеристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией В шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми, так и прямыми методами. Непрямая диагностика основана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов: Taql (в положении 11109-11113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinfl и Ddel); Taql в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ-анализа информативен только у 60-70% всех семей с гемофилией В [Сурин и др., 1994; Aseev M. et al., 1994 ]. Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection и прямое секвенирование продуктов амплификации [Montadon A.J. et al., 1990].

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белкового гено-продукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапии гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успешная трансдукция и коррекция генетического дефекта получены в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах [Gerrard A.J. et al., 1993; Culver K.W., 1994]. Так, при введении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX. После трансплантации этих трансду-цированных клеток nu/nu мышам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кровотоке и сохранялся там в течение недели [Gerrard A.J. et al., 1993]. На собаках, страдающих гемофилией В, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии рекомби-нантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию гена фактора IX в течение более 5 мес. и улучшение биохимических показателей свертываемости крови [Kay M.A. et al., 1993]. Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992 г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологичных фибробластов, предварительно трансдуциро-ванных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специалистов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофилии В - событие самого ближайшего будущего.

400 мутаций в гене гемофилии В

К 1994 г. идентифицированы около 400 мутаций в гене гемофилии В. Подавляющее большинство из них - замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно практически полное отсутствие выраженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T - встретилась в 7 семьях. Около 42% точечных мутаций возникают в CpG-динуклеотидах [Bottema C.D.K. et al., 1993]. Показано, что частота G-A- или С-Т-транзиций в CpG-сайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена [Koeberl D.D. et al., 1990]. Кроме того, в CpG-динуклеотидах гена F9 в 7,7 раз чаще возникают трансверсии (А-Т, А-С, G-T или G-C). Это объясняется тем, что содержание (G+C) в кодирующих областях F9-rem составляет 40% [Bottema C.D.K. et al., 1991].

В 40% случаев при тяжелых ингибиторных формах гемофилии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяженности. Около 10% точковых мутаций локализованы в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5 [Vidaud D. et al., 1993]. Описано 13 точковых мутаций в промоторной области гена F9. Именно с такими мутациями связана Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к возрасту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез. Объясняется это тем, что мугации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гормонзависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия В

 

Гемофилия В - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок (фактор IX) - гликопро-теин - состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде молекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фактор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из двух полипептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (Н), ко-валентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной сериновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с активацией фактора X посредством взаимодействий с ионами кальция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 1383 п.о. [Kurachi et al., 1982; Jagadeeswaran et al., 1984; Green et al., 1991; Giarmelli et al., 1993]. Для гена F9 характерна высокая частота возникновения мутаций -4,1-10 за поколение. Так же как и при гемофилии А, мутации значительно чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе [Montandon A.J. et al., 1992]. Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изолированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, составляет около 42 лет [King S.etal., 1992].

Генно-инженерные подходы в терапии

Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови, генно-инженерные подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде полноценного белкового продукта (заместительная терапия) либо на введение в организм больного соответствующей кДНК, обеспечивающей синтез фактора VIII и его поступление в кровь. Осуществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого заболевания находится на стадии экспериментальных разработок (см. главу 9). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффективного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длительную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возможных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты, гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994 г. методом направленного мутагенеза (см. главу 8) получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания начнутся уже в ближайшем будущем.