ОРГАНИЗАЦИЯ СЛУЖБЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ В РОССИИ

 

В предыдущей главе мы уже рассмотрели основные моногенные наследственные болезни, по которым в России возможна молекулярная диагностика, а также указали те основные диагностические центры страны, где она проводится. В заключительной главе нам представляется целесообразным рассмотреть некоторые аспекты общей структуры медико-генетической службы (МТС) России, обратив основное внимание на службу пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней.

Известно, что эффективная профилактика наследственных болезней может быть достигнута при рациональной организации и использовании пяти основных подходов:

¦ медико-генетического консультирования;

¦ пренатальной диагностики;

¦ массового скринирования новорожденных на наследственные болезни;

¦ диспансеризации, включающей проспективное консультирование семей высокого риска и активное выявление гетерозиготных носителей мутантных генов;

¦ контроль за мутагенными факторами окружающей среды [Козлова СИ., 1987].

Структура организации МГС России, принципы взаимоотношения ее подразделений, их конкретные функции, кадровое и аппаратурное обеспечение и регламентация работы персонала подробно изложены в Приказе Минздрава РФ № 316 от 30.12.1993 г. Согласно данному приказу, МГС построена по территориальному принципу и включает три основных уровня: районный (городской), региональный (межрегиональный) и федеральный.

Районный (городской) уровень представлен консультативными кабинетами по медицинской генетике, число которых уже в 1990 г. достигало 115 [Козлова СИ., 1990J. В обязанности врача-генетика или врача, прошедшего специализацию по медицинской генетике, входят следующие обязанности: выявление семей, отягощенных наследственной патологией; их направление для уточнения диагноза в региональный центр; диспансерное наблюдение за лицами с выявленной патологией.

Атаксия Фридрейха

Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1:22000 - 25000 ) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9ql3-q21) и физических картах ДНК-маркеров. Наиболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5 (зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген АФ. Определено положение гена АФ по отношению к другим фланкирующим молекулярным маркерам [Fujita R. et al., 1991; Wilkes D. et al., 1991]. В настоящее время известно, по крайней мере, 5 таких ДНК-маркеров: дистальные - GS4, МСТ-112, GS2 и проксимальные - микро-сателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 тыс. п.о.) и MLS1 (на расстоянии 150 тыс. п.о.). Изучены особенности аллельного полиморфизма этих систем для различных популяций Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих микросателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывает их весьма близкое расположение на генетической карте по отношению к мутант-ному гену АФ [Pianese L. et al., 1994].

Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами. Проводится ПДРФ-анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты либо ПЦР-анализ полиморфизма проксимальных по отношению к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.

Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследственные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя главным образом из того, насколько они изучены с молекулярно-генетических позиций, их актуальности для пренатальной диагностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так, что именно такие заболевания, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурйя, т. е. социально наиболее значимые, раньше других генных болезней стали предметом детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987; Баранов B.C., 1991; 1994; BaranovV.S., 1993].

Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объектами молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные. болезни как гиперхолестеринемия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1-антитрипсина, митохондриальные болезни. Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ведутся исследования по генотерапии. Мы не касались также работ, проводимых главным образом в возглавляемой профессором Е.И. Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных заболеваний, таких как диабет, гипертония, ишемия сердца.

Непосредственная близость от теломерного конца гена SMN

В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора запрограммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein - NAIP). При тяжелых клинических формах СМА (тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.

Согласно гипотезе авторов, СМА возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно - делений) в гене SMN, при этом различия между формами СМА определяются двумя основными факторами: во-первых, числом копий гена CBCD541 (двумя - в случае типа I и четырьмя, возникающими вследствие конверсии между SMN и cBCD541, - в случае типа III), во-вторых, наличием или отсутствием гена NAIP. Среди всех обследованных СМА-больных не обнаружены случаи одновременной делеции обоих гомологичных генов - SMN (tBCD541) и CBCD541, что указывает, по мнению авторов, на то, что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.

Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточнения, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молекулярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью проводится амплификация экзона 7, который отсутствует у подавляющего большинства бол*>ных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) дифференцируют от мутантного варианта (ген CBCD541) с помощью SSCP-анализа. При необходимости возможна косвенная диагностика - ПЦР-анализ динуклеотидных (СА) повторов ДНК-локусов D5S125, D5S112, D5S127, ПДРФ-анализ с фланкирующими ДНК-зондами MU, 105-153RA, 153-6741GT.

Спинальная мышечная атрофия

 

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессивное заболевание - характеризуется поражением моторных нейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища. Это - второе после муковис-цидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1:6000 новорожденных).

СМА подразделяется на три клинические формы:

¦ тип I - острая форма (болезнь Верднига - Гоффмана), проявляется в первые 6 мес. жизни и приводит к смерти уже в первые два года;

¦ тип II - средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять, но обычно живут более 4 лет;

¦ тип III - ювенильная форма (болезнь Кугельберга - Веландера) -прогрессирующая мышечная слабость после 2 лет.

Все три формы представляют собой аллельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5ql3) и идентифицированного методом позиционного клонирования (см. главу 3) в 1995 г. [Lefebvre S. et al., 1995]. В этой, пока единственной, работе показано, что ген SMN размером всего 20000 п.о. состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярной массой 32 кД.

Ген дуплицирован. Его копия (возможно, вариант псевдогена) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-точечных мутаций, позволяющих отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследования методом SSCP анализа (см. главу 4). Ген назван CBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т. е. гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но, в отличие от гена SMN, его кДНК подвергается альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7. Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229), его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5,6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся 3 больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отметить, что центромерная копия гена обнаружена у 95,5% больных, тогда как отсутствует она только у 4,4% пациентов.

Адреиогеиитальиый синдром

 

Адреногенитальный синдром - (врожденный дефицит 21 -гидрокси-лазы) - достаточно распространенное аутосомно-рецессивное заболевание. Частота «классических» форм -1:10000 новорожденных, «неклассической» - около 1% в популяции. В зависимости от характера нарушения функции гена и, соответственно, клинических проявлений «классическая» форма подразделяется на два варианта: летальная соль-теряющая форма и нелетальная - вирилизирующая форма, связанная с избытком андрогенов [Morel Y., MillerW.L., 1991].

В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных 21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псевдоген -CYP21A, неактивный вследствие делеции в 3-м экзоне, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс-мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фактор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину 3,4 тыс. п.о. и отличаются только по 87 нук-леотидам. Высокая степень гомологии и тандемное расположение указывают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить, что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы (называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитающих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого скота функционально активны оба гена.

Белок - 21-гидроксилаза (Р450с21 - микросомальный цитохром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в 11-дезоксикор-тизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон. В случае нарушения первого процесса возникает дефицит глюкокортикоидов, и прежде всего кортизола, что, в свою очередь, стимулирует синтез АКТГ и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогестерон ведет к дефициту аль-достерона, что, в свою очередь, нарушает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (сольтеряющая форма).

Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК-последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген) либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсии - 20%, и примерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечественным данным, в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС на долю конверсии приходится более 20% мутантных хромосом, на долю делеций - около 10% [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA А- и HLA В-генов, а также аллелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК-диагностика АГС основана на амплификации с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами НаеШ или Rsal и анализе полученных фрагментов после электрофореза [Evgrafov O.V. etal., 1995].

Болезнь Вильсоиа-Коиовалова

 

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медьсодержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участвующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК [Сох D.W. et al., 1972]. При редкой атипичной форме, предположительно германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и ювенильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравнительно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной Европе, и ведущими в этиологии заболевания являются печеночные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с поздним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных.

Ген БВК, идентифицированный в 1993 г. независимо сразу в двух лабораториях США, представляет собой медь-транспортирующую АТФазу Р типа с 6 металл-связывающими районами [Bull P.C. et al., 1993; Petruchin К. et al., 1993; Tanzi R.E. et al., 1993; Thomas et al., 1995]. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее идентифицированным геном АТФазы (АТР7А), мутантным при болезни Менкеса. По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в кодирующей области гена АТР7В, что доказывало его идентичность гену БВК [Petruchin К. et al., 1993]. Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена (6, 7, 8, 12 и 13).

Кодируемый АТР7В-геном белок содержит несколько мембранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилиро-вания и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сайта. В мозге, печени, почках и лимфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвестны. В гене АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры, а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс-мутации, 15 - миссенс-мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации Hisl070Gln и Glyl267Lys, зарегистрированные в 28% и 10% всех мутантных хромосом, соответственно [Thomas G.R. et al., 1995].

В заключение данного раздела представляется целесообразным кратко рассмотреть другие достаточно частые моногенные заболевания, для которых показана и проводится молекулярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других медико-генетических центрах России, и прежде всего, в Лаборатории молекулярной диагностики Института клинической генетики РАМН (Москва) [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек

Описаны редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации Х-хромосомы, не содержащей мутации [Ogasawara N. et al., 1989]. Однако у 3 женщин - облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене - селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фибробластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в Х-хромосоме, что и приводит к селекции клона клеток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT) Х-хро-мосомой [Marcus S. et al., 1993].

Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на проведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации, SSCP-анализе одноцепочеч-ных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см. главу 6). Косвенная диагностика предусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи полиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 -30HflStl4/TaqI).

Как мы уже отмечали, первая трансгенная животная модель наследственного заболевания человека, сконструированная путем направленного переноса мутаций в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана [Hooper M. et al., 1987; Kuehn M.R. et al., 1987]. На этой модели впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяющих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще, синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения многих теоретических вопросов биологии и медицины [Seegmiller J.E., 1989; Boyd et al., 1993; Marcus et al., 1993]. Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT (или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клетки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегодняшний день отсутствуют