Эволюция генотерапии

Еще больше этических и моральных вопросов порождает генотерапия. Однако и в этой области наметилась определенная эволюция взглядов как специалистов, так и широкой общественности. От полной неприемлемости такого подхода в 70-80-х годах уходящего века до признания безопасности (при соблюдении необходимых правил) генноин-женерных манипуляций на соматических клетках. Между тем логика подсказывает, что по мере того, как все большее число соматических мутаций удастся исправить с помощью генной терапии, значительнее будет их вклад на уровне половых клеток. Тем больше будет шанс того, что при вступлении в брак гомозигот по аутосомно-рецессивным заболеваниям (а вероятность такого события будет возрастать по мере совершенствования методов лечения генетических болезней), все дети будут здоровы, хотя и получат от своих родителей мутантные гены. Это станет особенно реальным в связи с успешной разработкой методологии доимплантационной диагностики наследственных болезней. Поэтому в научной литературе все настойчивее звучит тема генокоррекции на уровне половых клеток или ранних зародышей человека. Современный методический уровень пока еще не позволяет с абсолютной уверенностью осуществлять направленный перенос гена в половые клетки и клетки дробящихся зародышей. Пока этого удалось достичь только в экспериментах с эмбриональными стволовыми клетками, причем на 1-м этапе возникший организм в действительности является мозаиком по введенному гену. Естественно, это не означает, что проблема гомологичной рекомбинации нормального и мутантного гена на уровне половых клеток и ранних зародышей принципиально неразрешима. Однако потребуется еще много времени, возможно, не одно десятилетие XXI в., прежде чем эта задача будет успешно решена. В настоящее время мнение специалистов и широкой общественности - максимально предотвратить возможность попадания чужеродного генетического материала в половые клетки с тем, чтобы избежать непредсказуемых, а скорее всего весьма печальных последствий для человечества такого трансгеноза.

«Генетический паспорт новорожденных»

Да, уже сейчас вполне реально говорить о «генетическом паспорте новорожденных», т. е. о том, что уже вскоре после рождения с помощью автоматизированной системы удастся проанализировать весь спектр наиболее частых мутаций широко распространенных заболеваний как моногенной, так и мультифакториальной природы, в том числе и генов, мутации которых с высокой вероятностью могут привести к раку молочной железы, толстого кишечника, к атеросклерозу, диабету и многим другим тяжелым недугам. Жить, ни в чем себя не ограничивая, засунув как страус голову в песок, либо, зная, что имеешь мутацию в гене глута-тионтрансферазы (а, следовательно, высокую вероятность болезней легких, особенно рака), воздержаться от курения? Что лучше, добровольные ограничения и периодические осмотры или состояние счастливого неведения, грозящее неминуемой катастрофой? А скольких мультифи-акториальных заболеваний можно избежать, зная о слабых и сильных сторонах своего генома! В настоящее время в США проводятся массовые опросы населения, цель которых выяснить целесообразность досимптоматической диагностики в семьях высокого риска, доступность или конфиденциальность этой информации для членов семьи, нанимателей, страховых компаний и пр. Иными словами, практически овладев плодом Древа Познания - собственным геномом - человечество поставлено перед дилеммой: как сделать так, чтобы польза от него оказалась много весомее, чем потенциальный вред. Не случайно, сегодня уже на новом, молекулярном уровне всплывают идеи «улучшения человеческой породы» Фрэнсиса Гальтона, правда, не имеющие ничего общего с примитивной евгеникой прошлого. Обрели реальность и казавшиеся невозможными в недалеком прошлом идеи патентования отдельных генов и их фрагментов, потенциально особенно перспективных для молекулярной диагностики и биотехнологий. Несмотря на протесты руководителей программы «Геном человека» Фрэнсиса Коллинса, Томаса Каски и широкой научной общественности, патентоспособность генома человека, по крайней мере, его отдельных фрагментов, генов (например, гена BRCA-1- мутации которого резко увеличивают вероятность рака молочной железы) получила одобрение законодательных комитетов США.

«Геном человека»

Однако само по себе завершение гигантского по замыслу и грандиозного по реализации научного проекта «Геном человека» отнюдь не означает, что процесс познания генома завершен. Уже сейчас становится очевидным, что не существует какого-то усредненного генома человека: каждый геном, как и каждый человек, сугубо индивидуален. Эта индивидуальность генома проявляется не только на уровне отдельной личности, но и на уровне этнических групп, наций, отдельных популяций и рас [Cavalli-Sforsa L.L., 1993]. Геном человека как система динамичная очень разнообразен. Анализ этого разнообразия (diversity) - одно из важнейших продолжений программы «Геном человека». Еще более актуальным является выяснение «функциональной карты генома». Секвенирование позволит расшифровать порядок всех 3,5x109 нуклео-тидов. Но ведь это только начало. Определить границы генов, выяснить положение многочисленных регуляторных элементов, их интронно-экзонную структуру и, наконец, функциональное назначение каждого из 60 000 генов, роль которых пока неизвестна, - вот следующая, поистине глобальная задача молекулярной генетики. Вполне вероятно, что именно на этом пути удастся решить загадку «избыточной ДНК», понять эволюцию (филогенез) генома человека и, возможно, расшифровать партитуру симфонии жизни - т. е. последовательность включения и выключения генов в ходе онтогенеза.

На генетические карты человека уже в 1994 г. нанесены 933 гена, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям, причем более 400 из них проклонированы, т. е. выделены в чистом виде и размножены вне организма человека в составе ДНК фагов, вирусов, дрожжей и бактерий. Для многих из этих генов, в особенности сопряженных с наиболее частыми, социально значимыми заболеваниями, подробно изучены спектры мутаций, охарактеризованы аллельные полиморфизмы и разработаны схемы молекулярной диагностики. Причем, если в 1993 г. таких заболеваний было около 130 (R. Williamson), то в 1994 г. - более 600. По сути уже сегодня каждый наследственный недуг, ген которого картирован, доступен молекулярной диагностике прямыми или косвенными методами.

Помимо моногенных болезней, проблемы молекулярной диагностики которых в значительной степени уже решены, все больше внимания сегодня уделяется мультифакториальным заболеваниям. На повестке дня молекулярная диагностика предрасположенности к таким широко распространенным недугам, как атеросклероз, ишемия сердца, онкологические, психические заболевания, диабет и мн. др. Выяснение генетической природы этих болезней, равно как досимптоматическая диагностика многих моногенных болезней с поздней манифестацией, ставит перед исследователями, т. е. молекулярными биологами и врачами, проблему целесообразности такой досимптоматической диагностики, права личности на исключительность знаний о собственном геноме, точнее о тех мутациях и генетических предрасположенностях, которые закодированы в нем еще до рождения. Для некоторых заболеваний (муковис-цидоз, фенилкетонурия) такая ранняя диагностика, безусловно, целесообразна, так как позволяет начать лечение до начала заболевания. Для тех же нозологии, где реальной терапии пока нет (хорея Гентингтона, другие болезни «экспансии», миодистрофия Дюшенна и др.), целесообразность такой диагностики и, главное, конфиденциальность полученной информации широко обсуждаются.

Международная программа «Геном человека»

Справедливости ради, надо сказать, что серьезное отставание в адекватной информации широкой общественности о возможностях молекулярной диагностики, перспективах генной терапии и революции в генетике, связанной с реализацией Международной программы «Геном человека», характерно не только для нашей страны, но констатируется и в глобальном масштабе. Службы научной информации передовых западных стран, прежде всего США, намечают целую серию общеобразовательных мероприятий в масштабе государства с целью подготовить мировую общественность к тем возможным сюрпризам как позитивного, так и негативного свойства, которые может повлечь за собой расшифровка генома человека, идентификация всех его генов, возможности их клонирования и использования для коррекции наследственных дефектов. Медицинские, социальные, правовые, этические и многие другие вопросы, которые возникают по мере познания генома человека, должны занять достойное место и в медико-генетической службе нашей страны. В определенной мере именно этой цели и служит данная монография.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При всем разнообразии тем, затронутых в монографии, весь изложенный в ней материал по сути касается трех основных проблем:

¦ генетического картирования и генома человека;

¦ молекулярной диагностики генных болезней;

» генокоррекции наследственных дефектов и генотерапии.

В решении каждой из названных проблем достигнуты серьезные успехи. Напомним некоторые из них.

Известно, что первый ген человека (ген цветной слепоты - дальтонизма) картирован на Х-хромосоме человека в 1911 г., первый ауто-сомный ген - только в 1968 г. К 1973 г. на всех хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к 1994 г. на генетических картах уже локализованы свыше 60000 маркерных ДНК-последовательностей (главным образом, фрагментов кДНК экспрессирующихся генов -EST, см. главу 3), а также более 5000 полноразмерных структурных генов. Благодаря многочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микросателлитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2 сМ) генетические карты для каждой хромосомы человека. Это позволило перейти от функционального к позиционному картированию, т. е. картированию новых генов непосредственно на физической карте ДНК целого генома.

По мнению авторитетных специалистов по генетическому картированию, таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и других, дальнейшее наращивание плотности молекулярных маркеров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что в процессе идентификации все новых и новых генов методом EST новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее оптимистично обстоят дела и с секвени-рованием, т. е. выяснением первичной нуклеотидной последовательности всей двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеотидов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40 центов и продолжает снижаться. Причина этого - широкая автоматизация монотонного процесса секвенирования. Так, 10 роботов фирмы Applied Biosystems за одну неделю секвенируют более 30 000 000 пар оснований. Дальнейшее совершенствование технологии секвенирования, создание принципиально новых подходов (метод «чипов» - А.Д. Мирзабеков, Ed. Southern),

Уникальные особенности в организации медико-генетической службы

Вполне естественно, что в зависимости от географических, исторических и социальных особенностей в каждом регионе и в каждом крупном городе существуют свои уникальные особенности в организации медико-генетической службы, в том числе и службы пренатальнои диагностики. Например, структура службы пренатальнои диагностики в Санкт-Петербурге существенно отличается от таковой в Москве. Исторически сложилось так, что именно в Ленинграде, благодаря усилиям работавшего здесь после войны выдающегося невропатолога и генетика С.Н. Давиденкова, уже в 1960 году, впервые в СССР, была организована медико-генетическая консультация, превратившаяся со временем в Медико-генетический Центр города. В 1989 г. на базе лаборатории прена-тальной диагностики НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН был организован Городской центр пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней. Именно эти два учреждения и составили основу медико-генетической службы города. Их содружество с другими научными и высшими учебными заведениями города (лабораторией биохимической генетики НИИЭМ РАМН, отделом биологии Института ядерной физики им. Н. Константинова, кафедрой генетики Педиатрической медицинской академии и др.) позволило значительно расширить число диагностируемых нозологических форм, а их научные разработки явились серьезным стимулом к развитию молекулярных исследований в области медицинской генетики в стране.

Вместе с тем нельзя не отметить наметившийся и быстро увеличивающийся разрыв между научными разработками передовых центров и лабораторий и практической службой медицинской генетики в области молекулярной диагностики. Благодаря своей универсальности, методы ДНК-диагностики могут быть использованы для диагностики самых разных наследственных заболеваний, список которых по мере увеличения числа картированных и клонированных генов стремительно нарастает. Их число приближается уже к тысяче. В то же время число реально диагностируемых молекулярными методами болезней в России не превышает 20. Причина этого, как ни парадоксально, в отсутствии уже отобранных и диагностированных клинически либо иными методами семей высокого риска, т. е. в низком уровне медико-генетической службы и особенно ее биохимических отделов в масштабах всей страны. До сих пор медико-генетическая служба России не располагает оперативными (компьютеризированными) региональными и, следовательно, федеральными регистрами наследственных болезней. Нам неизвестны реальные потребности того или иного региона страны в молекулярной диагностике, в том числе и в пренатальной, даже тех нозологии, для которых уже существуют и широко используются молекулярные исследования. Плохая осведомленность не только населения, но даже врачей, включая работников медико-генетической службы, о реальных возможностях пренатальной диагностики наследственных болезней в нашей стране зачастую ведет к досадным недоразумениям, когда семьи высокого риска, обратившись за помощью в зарубежные центры, получают рекомендацию провести необходимые исследования в России, где запрашиваемая диагностика не только вполне осуществима, но и проводится бесплатно.

Консультативно-методический совет медико-генетической службы Минздрава РФ

Учитывая некоторые исторические особенности становления -пренатальнои диагностики в нашей стране [Баранов В. С, 1987; 1990; 1994], относительно высокую стоимость молекулярных исследований, кажется вполне оправданным наличие определенной комплементарности в распределении диагностируемых нозологии по центрам. Так, за нашим центром в Санкт-Петербурге, первым в стране начавшим использовать молекулярные методы в пренатальнои диагностике моногенных болезней, закрепилась молекулярная диагностика муковисцидоза, мио-дистрофии Дюшенна, гемофилии А и В, синдрома ломкой Х-хромосомы, фенилкетонурии, миотонической дистрофии. В лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (Москва ) успешно диагностируются спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана, адреногенитальный синдром, болезнь Вильсона-Коновалова, атаксия Фридрейха, синдром Аль-порта, некоторые формы агаммаглобулинемии, а также болезнь Шарко-Мари-Тус.

Помимо молекулярной диагностики, ФМГЦ (г. Томск) занимается разработкой и апробацией новых методов диагностики, лечения и реабилитации больных с наследственной патологией, подготовкой и повышением квалификации специалистов других медико-генетических учреждений, контролем за ведением региональных регистров семей с наследственными болезнями; созданием банка ДНК-данных по нозологи-ям, разработкой научно-практических программ.

Высшим звеном медико-генетической службы страны является Консультативно-методический совет медико-генетической службы Минздрава РФ, который состоит из ведущих ученых и практических работников по медицинской генетике. В задачу совета, состоящего из 18 человек, входят методическое руководство и оказание практической помощи медико-генетической службе страны; разработка планов централизованной закупки и распределения по центрам необходимого оборудования, реактивов, лекарств и лечебного питания, диагностикумов для проведения скринирующих программ; планы подготовки кадров; практическая помощь в создании компьютеризированных регистров; контроль за качеством и эффективностью работы всех уровней медико-генетической службы.

Медико-генетические консультации

Региональный уровень представлен медико-генетическими консультациями (центрами), которые формируются уже как самостоятельные учреждения или в составе лечебно-профилактичесих учреждений (ЛПУ) и выполняют такие важные функции, как:

¦ медико-генетическое консультирование с использованием специальных лабораторных методов для уточнения диагноза;

¦ скрининг беременных путем ультразвукового обследования и анализа сывороточных маркерных белков (ос-фетопротеина и хорио-нального гонадотропина) для выявления женщин, имеющих повышенный риск рождения детей с грубыми аномалиями центральной нервной системы и хромосомными болезнями;

¦ пренатальную цитогенетическую диагностику хромосомных болезней плода у женщин старшей возрастной группы (39 лет и более);

¦ селективный скрининг семей на наследственные метаболические болезни;

¦ массовый скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз;

¦ ведение территориального регистра семей и больных с наследственной и врожденной патологией.

На базе научно-исследовательских институтов и областных МГК могут создаваться межрегиональные МГК, выполняющие помимо вышеперечисленных функций дополнительные виды специализированной диагностики сложных случаев, а также обеспечивающих лечение больных с фенилкетонурией. В стране насчитывается 16 региональных и межрегиональных МГЦ.

Наконец, приказом Минздрава РФ на базе ведущих НИИ России созданы шесть Федеральных медико-генетических центров: по одному в Санкт-Петербурге и Томске и четыре - в Москве. Существенно, что в особенно сложных случаях дифференциальная диагностика наследственной и врожденной патологии проводится с использованием не только цитогенетических и биохимических, но и молекулярных методов. Таким образом, практически только на федеральном уровне становится доступной молекулярная диагностика наследственных болезней как в пост-натальном периоде, т. е. у больных, так и на пренатальных стадиях развития, т. е. у ппода. Реально ДНК-диагностика моногенных болезней проводится только в двух федеральных центрах: в Санкт-Петербурге на базе лаборатории пренатальной диагностики НИИАГ им. ДО. Отга РАМН и в Москве - в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. Первые попытки молекулярной диагностики отдельных нозологии предприняты в Институте медицинской генетики РАМН в ФМГЦ г. Томска. Ряд специализированных НИИ России также проводят молекулярную диагностику отдельных наследственных заболеваний

ОРГАНИЗАЦИЯ СЛУЖБЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ В РОССИИ

 

В предыдущей главе мы уже рассмотрели основные моногенные наследственные болезни, по которым в России возможна молекулярная диагностика, а также указали те основные диагностические центры страны, где она проводится. В заключительной главе нам представляется целесообразным рассмотреть некоторые аспекты общей структуры медико-генетической службы (МТС) России, обратив основное внимание на службу пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней.

Известно, что эффективная профилактика наследственных болезней может быть достигнута при рациональной организации и использовании пяти основных подходов:

¦ медико-генетического консультирования;

¦ пренатальной диагностики;

¦ массового скринирования новорожденных на наследственные болезни;

¦ диспансеризации, включающей проспективное консультирование семей высокого риска и активное выявление гетерозиготных носителей мутантных генов;

¦ контроль за мутагенными факторами окружающей среды [Козлова СИ., 1987].

Структура организации МГС России, принципы взаимоотношения ее подразделений, их конкретные функции, кадровое и аппаратурное обеспечение и регламентация работы персонала подробно изложены в Приказе Минздрава РФ № 316 от 30.12.1993 г. Согласно данному приказу, МГС построена по территориальному принципу и включает три основных уровня: районный (городской), региональный (межрегиональный) и федеральный.

Районный (городской) уровень представлен консультативными кабинетами по медицинской генетике, число которых уже в 1990 г. достигало 115 [Козлова СИ., 1990J. В обязанности врача-генетика или врача, прошедшего специализацию по медицинской генетике, входят следующие обязанности: выявление семей, отягощенных наследственной патологией; их направление для уточнения диагноза в региональный центр; диспансерное наблюдение за лицами с выявленной патологией.

Атаксия Фридрейха

Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1:22000 - 25000 ) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на хромосомных (9ql3-q21) и физических картах ДНК-маркеров. Наиболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5 (зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и составлены подробные физические карты области геномной ДНК хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген АФ. Определено положение гена АФ по отношению к другим фланкирующим молекулярным маркерам [Fujita R. et al., 1991; Wilkes D. et al., 1991]. В настоящее время известно, по крайней мере, 5 таких ДНК-маркеров: дистальные - GS4, МСТ-112, GS2 и проксимальные - микро-сателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 тыс. п.о.) и MLS1 (на расстоянии 150 тыс. п.о.). Изучены особенности аллельного полиморфизма этих систем для различных популяций Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих микросателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом неравновесии с АФ, что доказывает их весьма близкое расположение на генетической карте по отношению к мутант-ному гену АФ [Pianese L. et al., 1994].

Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами. Проводится ПДРФ-анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайты либо ПЦР-анализ полиморфизма проксимальных по отношению к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.

Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследственные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя главным образом из того, насколько они изучены с молекулярно-генетических позиций, их актуальности для пренатальной диагностики и в какой мере они важны для медико-генетической службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так, что именно такие заболевания, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурйя, т. е. социально наиболее значимые, раньше других генных болезней стали предметом детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в других медико-генетических центрах и научно-практических подразделениях России [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987; Баранов B.C., 1991; 1994; BaranovV.S., 1993].

Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не исчерпывается список тех болезней, которые являются объектами молекулярных исследований в нашей стране. Например, из обзора выпали такие моногенные. болезни как гиперхолестеринемия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1-антитрипсина, митохондриальные болезни. Для многих из них разработаны и широко применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ведутся исследования по генотерапии. Мы не касались также работ, проводимых главным образом в возглавляемой профессором Е.И. Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и посвященных молекулярному анализу мультифакториальных заболеваний, таких как диабет, гипертония, ишемия сердца.

Непосредственная близость от теломерного конца гена SMN

В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора запрограммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis inhibitory protein - NAIP). При тяжелых клинических формах СМА (тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко происходит утрата гена NAIP.

Согласно гипотезе авторов, СМА возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно - делений) в гене SMN, при этом различия между формами СМА определяются двумя основными факторами: во-первых, числом копий гена CBCD541 (двумя - в случае типа I и четырьмя, возникающими вследствие конверсии между SMN и cBCD541, - в случае типа III), во-вторых, наличием или отсутствием гена NAIP. Среди всех обследованных СМА-больных не обнаружены случаи одновременной делеции обоих гомологичных генов - SMN (tBCD541) и CBCD541, что указывает, по мнению авторов, на то, что такая аберрация должна проявляться как доминантная леталь еще в эмбриогенезе.

Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточнения, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молекулярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью проводится амплификация экзона 7, который отсутствует у подавляющего большинства бол*>ных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) дифференцируют от мутантного варианта (ген CBCD541) с помощью SSCP-анализа. При необходимости возможна косвенная диагностика - ПЦР-анализ динуклеотидных (СА) повторов ДНК-локусов D5S125, D5S112, D5S127, ПДРФ-анализ с фланкирующими ДНК-зондами MU, 105-153RA, 153-6741GT.

Спинальная мышечная атрофия

 

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессивное заболевание - характеризуется поражением моторных нейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и мышц туловища. Это - второе после муковис-цидоза наиболее частое летальное моногенное заболевание (частота 1:6000 новорожденных).

СМА подразделяется на три клинические формы:

¦ тип I - острая форма (болезнь Верднига - Гоффмана), проявляется в первые 6 мес. жизни и приводит к смерти уже в первые два года;

¦ тип II - средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять, но обычно живут более 4 лет;

¦ тип III - ювенильная форма (болезнь Кугельберга - Веландера) -прогрессирующая мышечная слабость после 2 лет.

Все три формы представляют собой аллельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусе D5S125 (5ql3) и идентифицированного методом позиционного клонирования (см. главу 3) в 1995 г. [Lefebvre S. et al., 1995]. В этой, пока единственной, работе показано, что ген SMN размером всего 20000 п.о. состоит из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1700 п.о. и кодирует ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с молекулярной массой 32 кД.

Ген дуплицирован. Его копия (возможно, вариант псевдогена) располагается несколько ближе к центромере и отличается от гена SMN наличием 5-точечных мутаций, позволяющих отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследования методом SSCP анализа (см. главу 4). Ген назван CBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для теломерной копии, т. е. гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, но, в отличие от гена SMN, его кДНК подвергается альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7. Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229), его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных пациентов (5,6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся 3 больных дали основание именно данную теломерную копию гена считать ответственной за заболевание. Существенно отметить, что центромерная копия гена обнаружена у 95,5% больных, тогда как отсутствует она только у 4,4% пациентов.

Адреиогеиитальиый синдром

 

Адреногенитальный синдром - (врожденный дефицит 21 -гидрокси-лазы) - достаточно распространенное аутосомно-рецессивное заболевание. Частота «классических» форм -1:10000 новорожденных, «неклассической» - около 1% в популяции. В зависимости от характера нарушения функции гена и, соответственно, клинических проявлений «классическая» форма подразделяется на два варианта: летальная соль-теряющая форма и нелетальная - вирилизирующая форма, связанная с избытком андрогенов [Morel Y., MillerW.L., 1991].

В локусе 6р21.3, внутри сложного супергенетического комплекса HLA идентифицированы два тандемно расположенных 21-гидроксилазных гена - функционально активный CYP21B и псевдоген -CYP21A, неактивный вследствие делеции в 3-м экзоне, инсерции со сдвигом рамки считывания в 7-м экзоне и нонсенс-мутаций - в 8-м экзоне. Ген и псевдоген разделены смысловой последовательностью гена С4В, кодирующей 4-й фактор комплемента. Оба гена состоят из 10 экзонов, имеют длину 3,4 тыс. п.о. и отличаются только по 87 нук-леотидам. Высокая степень гомологии и тандемное расположение указывают на общность эволюционного происхождения этих генов. Любопытно отметить, что такие же тандемно расположенные гены 21-гидроксилазы (называемые также Р450с21) обнаружены и у других млекопитающих, причем у мышей, в отличие от человека, активен только ген CYP21A, но не CYP21B, тогда как у крупного рогатого скота функционально активны оба гена.

Белок - 21-гидроксилаза (Р450с21 - микросомальный цитохром 450) обеспечивает превращение 17-гидроксипрогестерона в 11-дезоксикор-тизол и прогестерона - в дезоксикортикостерон. В случае нарушения первого процесса возникает дефицит глюкокортикоидов, и прежде всего кортизола, что, в свою очередь, стимулирует синтез АКТГ и ведет к гиперплазии коры надпочечников (вирилирующая форма). Нарушение превращения прогестерона в дезоксипрогестерон ведет к дефициту аль-достерона, что, в свою очередь, нарушает способность почек удерживать ионы натрия и приводит к быстрой потере соли плазмой крови (сольтеряющая форма).

Как и в случае гемофилии А, наличие рядом с кодирующим геном гомологичной ДНК-последовательности зачастую ведет к нарушениям спаривания в мейозе и, как следствие этого, к конверсии генов (перемещения фрагмента активного гена на псевдоген) либо к делеции части смыслового гена. В обоих случаях функция активного гена нарушается. На долю делеций приходится около 40% мутаций, на долю конверсии - 20%, и примерно 25% составляют точечные мутации. Согласно отечественным данным, в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы АГС на долю конверсии приходится более 20% мутантных хромосом, на долю делеций - около 10% [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Непрямая диагностика АГС возможна с помощью типирования тесно сцепленных с геном CYP21B аллелей HLA А- и HLA В-генов, а также аллелей гена HLA DQA1. Прямая ДНК-диагностика АГС основана на амплификации с помощью ПЦР отдельных фрагментов генов CYP21B и CYP21A, их рестрикции эндонуклеазами НаеШ или Rsal и анализе полученных фрагментов после электрофореза [Evgrafov O.V. etal., 1995].

Болезнь Вильсоиа-Коиовалова

 

Болезнь Вильсона-Коновалова (БВК) - гепатолентикулярная дегенерация - аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное наследственным дефектом одной из медь-транспортирующих АТФаз. У больных резко снижена концентрация основного медьсодержащего белка плазмы крови - церулоплазмина и в меньшей степени - цитохромоксидазы, еще одного белка, участвующего в метаболизме меди. Выделяют, по крайней мере, 3 формы БВК [Сох D.W. et al., 1972]. При редкой атипичной форме, предположительно германского происхождения, у гетерозигот содержание церулоплазмина снижено, по крайней мере, в два раза. При двух других, типичных формах - славянской и ювенильной, содержание церулоплазмина у гетерозигот находится в пределах нормы. Славянский тип БВК характеризуется сравнительно поздним началом и преимущественно неврологической симптоматикой. Ювенильная форма чаще встречается в Западной Европе, и ведущими в этиологии заболевания являются печеночные нарушения. Среди евреев-ашкенази встречается БВК с поздним началом и почти нормальным содержанием церулоплазмина в сыворотке крови больных.

Ген БВК, идентифицированный в 1993 г. независимо сразу в двух лабораториях США, представляет собой медь-транспортирующую АТФазу Р типа с 6 металл-связывающими районами [Bull P.C. et al., 1993; Petruchin К. et al., 1993; Tanzi R.E. et al., 1993; Thomas et al., 1995]. Ген имеет 60% гомологию по нуклеотидному составу с ранее идентифицированным геном АТФазы (АТР7А), мутантным при болезни Менкеса. По аналогии с геном болезни Менкеса, также обусловленной нарушением транспорта меди, ген БВК назван АТР7В. Два пациента с БВК оказались гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в кодирующей области гена АТР7В, что доказывало его идентичность гену БВК [Petruchin К. et al., 1993]. Ген экспрессируется в клетках печени, мозга, почках, лимфоузлах. Типичным для экспрессии АТР7В оказался альтернативный сплайсинг двух и более экзонов центральной части гена (6, 7, 8, 12 и 13).

Кодируемый АТР7В-геном белок содержит несколько мембранных доменов, АТФ-консенсусную последовательность, сайт фосфорилиро-вания и, по крайней мере, 2 медь-связывающих сайта. В мозге, печени, почках и лимфоузлах обнаружены изоформы белка, соответствующие продуктам альтернативного сплайсинга гена АТР7В. Их назначение и функции пока неизвестны. В гене АТР7В идентифицированы полиморфные микросателлитные маркеры, а также около 10 полиморфных сайтов рестрикции. В настоящее время в гене АТР7В идентифицированы более 30 мутаций, в том числе 14 мелких делеций/инсерций, 2 - нонсенс-мутации, 15 - миссенс-мутаций, 3 - сплайсинговые мутации. Диагностическую ценность для европейцев представляют мутации Hisl070Gln и Glyl267Lys, зарегистрированные в 28% и 10% всех мутантных хромосом, соответственно [Thomas G.R. et al., 1995].

В заключение данного раздела представляется целесообразным кратко рассмотреть другие достаточно частые моногенные заболевания, для которых показана и проводится молекулярная диагностика, в том числе и пренатальная, в других медико-генетических центрах России, и прежде всего, в Лаборатории молекулярной диагностики Института клинической генетики РАМН (Москва) [Evgrafov O.V. et al., 1995].

Редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек

Описаны редкие случаи синдрома Леш-Нихана у гетерозиготных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации Х-хромосомы, не содержащей мутации [Ogasawara N. et al., 1989]. Однако у 3 женщин - облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене - селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фибробластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в Х-хромосоме, что и приводит к селекции клона клеток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT) Х-хро-мосомой [Marcus S. et al., 1993].

Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на проведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации, SSCP-анализе одноцепочеч-ных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см. главу 6). Косвенная диагностика предусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи полиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 -30HflStl4/TaqI).

Как мы уже отмечали, первая трансгенная животная модель наследственного заболевания человека, сконструированная путем направленного переноса мутаций в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана [Hooper M. et al., 1987; Kuehn M.R. et al., 1987]. На этой модели впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяющих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще, синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения многих теоретических вопросов биологии и медицины [Seegmiller J.E., 1989; Boyd et al., 1993; Marcus et al., 1993]. Сложность генокоррекции заболевания, однако, заключается в необходимости обеспечения эффективной доставки гена HPRT (или его кДНК) непосредственно в мутантные нервные клетки. Эта проблема еще не решена. Поэтому реальные клинические программы генотерапии этого заболевания на сегодняшний день отсутствуют

Синдром Леш-Нихаиа

Синдром Леш-Нихана - рецессивное, сцепленное с полом заболевание, обусловленное наследственной недостаточностью гипоксантингуа-нинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровождающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы. Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов, контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессирует-ся во всех типах клеток с образованием мРНК размером 654 п.о. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и 6-тиогуанину и, таким образом, могут быть отобраны на соответствующих селективных средах. Гетерозиготные носители мутаций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию двух типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных луковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молекулах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.

В 15% хромосом у больных с синдромом Леш-Нихана ген HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, которые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибридизации [Jolly et al., 1983; Edwards et al., 1990; Rossiter et al., 1991; Sculley et al., 1992]. Синдром Леш-Нихана - одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена молекулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой модели впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонуклеазой А в местах негомологичного спаривания (метод расщепления рибонуклеазой А) (см. главу 6) [Gibbs R.A., Caskey СТ., 1987]. Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонуклеазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, половина которых - однонуклеотидные замены типа миссенс-, нонсенс-мутации и мутации в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных экзонов и микроделеции одного или нескольких нуклеотидов. В HPRT-гене практически отсутствуют мутации, домининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключением является нонсенс-мутация R170TER, которая составляет около 15% всех нуклеотидных замен [Gibbs R.A. et al., 1989]. Так же как и при гемофилиях, мутации гена HPRT чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хромосомах 3, 5 и 11 [Stout J.T., Caskey СТ., 1985].

Косвенная диагностика мутаций в РАН-гене

В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в РАН-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод nHP/StyI-диагностики самой частой в России (более 70%) мутации R408W [Иващенко Т.Э. и др., 1993; Ivaschenko Т.Е., Baranov V.S., 1993]. Диагностика других мажорных мутаций в РАН-гене осуществляется методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом однонитевого информационного полиморфизма (SSCP) (см. главу 4) [Барановская С.С. и др., 1995]. При первичном обследовании семьи чрезвычайно удобно использовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232, 245 и 385, сцепленные в кавказских популяциях с определенными ПДРФ-гашготипами, а значит, и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрикции, и поэтому их аллельное состояние может быть легко протипировано с помощью амплификации и рестрикции [Kalaydjieva L. et al., 1991]. При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная диагностика может быть проведена с помощью внутригенных полиморфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Mspl-полиморфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции [Wedemeyer et al., 1993]. В последнее время появились данные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобными для молекулярного маркирования мутантных аллелей [Goltsov A. A. et al., 1992].

Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии экспериментальной разработки

Неравновесие по сцеплению

Внутри РАН-гена локализованы более 10 полиморфных сайтов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим маркерам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в РАН-гене и гаплотипами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5 наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоциирована только с одним из более чем 70 гаплотипов по 8 рестрикционным полиморфизмам [Eisensmith R.C. et al., 1992]. Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в донорном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 [DiLella A.G. et al., 1986]. В то же время другая мутация в экзоне 12 - R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в частности, в Белоруссии и России и не найденная в Японии и Китае, связана с гаплотипом 2 [DiLella A.G. et al.,1987]. Мажорная в Европе мутация R158Q в 40% случаев сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Турции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к 9-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с «южными» гаплотипами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморфным сайтам рестрикции и мутаций в РАН-гене в разных популяциях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод, что большинство из них или даже все произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам, эти мутации возникли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако в ряде случаев распределение мутаций не может быть объяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие популяционные частоты специфических мутаций в РАН-гене связаны, по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с существованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН-мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторыми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), развивающимися при хранении зерна и других продуктов [Woolf L.I., 1986]. Предполагается, что беременные женщины, гетерозиготные по РАН-мутациям, имеют меньшую вероятность аборта, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно, высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть объяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующим росту таких грибов.

Фенилкетонурия

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным дефектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Европе один больной ребенок встречается в среднем среди 10-17 тыс. новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новорожденных [DiLella A.G. et al., 1986]. Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1:8-10 тыс. Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевременном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин, умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скринирующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенила-ланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фермент, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 52 кД, продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фенилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфе-нилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридин-редуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отличаются от классической ФКУ и не корригируются диетой, лишенной фенилаланина.

РАН-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2,4 тыс. п.о. [Guttler F., Woo S.L.C., 1986; DiLella A.G. et al., 1986; Cotton R.G.H., 1990]. Наиболее распространенный тип мутаций - одно-нуклеотидные замены (миссенс-, нонсенс-мутации и мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом трансци-зий в 22 обнаруженных в РАН-гене CpG-динуклеотидах. Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется небольшой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций [Scriver C.R. et al., 1989]. Так, наибольшее число миссенс-мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где расположено 5 CpG-дуплетов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район локализации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Вил-лебранда

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики болезни Вил-лебранда в значительной мере предопределяется правильностью предшествующей клинической и лабораторной диагностики и результатами медико-генетического консультирования, позволяющими достаточно четко определить характер наследования заболевания в семье высокого риска и установить его форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно, а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижает эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с тем, по крайней мере в некоторых популяциях (Финляндия, Швеция), обнаружены «горячие» точки мутаций, которыми являются экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда [Holmberg L. et al., 1993]. В популяциях России такие «горячие» точки пока не обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся. Значительно более перспективной на современном этапе представляется непрямая диагностика. В промоторной части гена, в интронах 15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 идентифицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспективным для диагностики является полиморфизм интрона 40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплификация этой части интрона 40 с помощью ПЦР, рестрикция Alul с последующим электрофоретическим разделением позволяет идентифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма [Mercier В. et al., 1991]. Столь выраженный полиморфизм позволяют с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому (ген) и проследить ее передачу в потомстве.

Сведений о генокоррекции болезни Виллебранда в доступной литературе не обнаружено.

Замены аминокислот

Наибольшее число мутаций идентифицированы при типе II болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены аминокислот, чаще всего происходящие в результате трансцизий в CpG-динуклео-тидах [Cooney К.A. et al., 1991; Randi A.M. et al., 1991; Donner M. et al., 1992]. Мутации при болезни типа НА кластерированы в А2 домене, где предположительно локализован сайт протеолитического отщепления, в то время как при типе ИВ - в домене, обеспечивающем взаимодействие с тромбоцитарным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая группа мутаций при форме заболевания ПВ локализована в сегменте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509-м и 695-м положениях. При форме заболевания Нормандского типа, мимикрирующей гемофилию А, фактор Виллебранда структурно и функционально нормален, за исключением того, что нарушено его взаимодействие с фактором VIII. У таких пациентов действительно идентифицируются миссенс-мутации, расположенные в области гена, кодирующей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIC [Mazurier С, 1992].

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания, при которой фактор VIIIR, как правило, отсутствует. Получены доказательства, что такие пациенты являются гомозиготами или компаундами по нонсенс-мутациям, обнаруживаемым в одной дозе у больных типа I [Zhang Z.P. et al., 1992]. При этом же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки считывания, возникающих в результате деле-ции одного из 6 цитозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мутация была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон Виллебрандом в 1926 г. У некоторых членов этой родословной, как было установлено недавно, она находилась в компаунде с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) [Zhang Z.P. et al., 1993].

Болезнь Виллебранда

 

Болезнь Виллебранда - аутосомно-доминантное (при некоторых формах - рецессивное) заболевание, обусловленное наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору VIIIC свертывания крови (см. 10.4.3) и известного как фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезируется клетками эндотелия, в которых специфическая VIIIR-мРНК составляет 0,3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров с молекулярными весами от 850 тыс. до 20 млн дальтон. Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосудов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах повреждения эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции синтеза и секреции фактора VIIIC и стабилизирует комплекс фактора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и III [Zimmerman T.S., Ruggeri Z.M., 1987]. При типе I снижена концентрация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено. Генетически эта форма заболевания подразделяется на рецессивные и доминантные варианты. Типы ПС и III - рецессивны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать большие мультимеры (типы ПА и ПС) или в увеличении скорости их выведения из плазмы (тип ПВ).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов, размерами от 40 до 1379 п.о. [ Lynch et al., 1985; Bonthorn et al., 1986; Mancuso D.J. et al., 1989; Cooney et al., 1991; Randi et al., 1991]. Величина интронов варьирует в огромных пределах (от 100 п.о. до 20 тыс п.о.). Сигнальный пептид и пропептид кодируются первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субъединица VIIIR-фактора и З'-нетранслируемая область - остальными 35 экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся последовательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный ТСТА-повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гена, кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На хромосоме 22ql 1—q 13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 тыс. п.о., соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-reHa [Mancuso D.J. et al., 1991]. Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс-мутации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Модель для выработки стратегии генетического консультирования

Гемофилия В была использована как модель для выработки стратегии генетического консультирования при моногенных заболеваниях, обладающих выраженной мутационной гетерогенностью [Giannelli F. et al., 1992]. Основой такой стратегии является составление национальных баз данных молекулярных дефектов и специфических методов их диагностики. В частности, основываясь на подобной информации, авторы провели характеристику мутаций в группе из 170 неродственных индивидуумов с гемофилией В шведского и английского происхождения и только в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как непрямыми, так и прямыми методами. Непрямая диагностика основана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов: Taql (в положении 11109-11113); инсерционного полиморфизма в интроне А (рестриктазы Hinfl и Ddel); Taql в интроне F в положении 72. Метод ПДРФ-анализа информативен только у 60-70% всех семей с гемофилией В [Сурин и др., 1994; Aseev M. et al., 1994 ]. Прямая диагностика гемофилии В включает амплификацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection и прямое секвенирование продуктов амплификации [Montadon A.J. et al., 1990].

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белкового гено-продукта в сыворотке крови и наличие естественных биологических моделей способствовали быстрому прогрессу исследований по генотерапии гемофилии В, которая в настоящее время уже включена в программы клинических испытаний. Успешная трансдукция и коррекция генетического дефекта получены в опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных системах [Gerrard A.J. et al., 1993; Culver K.W., 1994]. Так, при введении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX. После трансплантации этих трансду-цированных клеток nu/nu мышам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся в кровотоке и сохранялся там в течение недели [Gerrard A.J. et al., 1993]. На собаках, страдающих гемофилией В, осуществлена трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии рекомби-нантного ретровирусного вектора в портальную вену. При этом наблюдали устойчивую экспрессию гена фактора IX в течение более 5 мес. и улучшение биохимических показателей свертываемости крови [Kay M.A. et al., 1993]. Имеется сообщение об успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992 г. Двум больным мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологичных фибробластов, предварительно трансдуциро-ванных ex vivo рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный скептицизм в оценке этого достижения со стороны специалистов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофилии В - событие самого ближайшего будущего.

400 мутаций в гене гемофилии В

К 1994 г. идентифицированы около 400 мутаций в гене гемофилии В. Подавляющее большинство из них - замены нуклеотидов, приводящие к заменам аминокислот или к образованию стоп-кодонов. Характерно практически полное отсутствие выраженных мажорных мутаций и доминирующих областей повышенной частоты мутирования. Только одна мутация - I397T - встретилась в 7 семьях. Около 42% точечных мутаций возникают в CpG-динуклеотидах [Bottema C.D.K. et al., 1993]. Показано, что частота G-A- или С-Т-транзиций в CpG-сайтах в 24 раза выше, чем в других местах гена [Koeberl D.D. et al., 1990]. Кроме того, в CpG-динуклеотидах гена F9 в 7,7 раз чаще возникают трансверсии (А-Т, А-С, G-T или G-C). Это объясняется тем, что содержание (G+C) в кодирующих областях F9-rem составляет 40% [Bottema C.D.K. et al., 1991].

В 40% случаев при тяжелых ингибиторных формах гемофилии В у пациентов обнаруживаются делеции различной протяженности. Около 10% точковых мутаций локализованы в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга или создают новые сайты сплайсинга внутри интронов. В одной семье разрушение гена произошло в результате инсерции Alu-элемента в экзон 5 [Vidaud D. et al., 1993]. Описано 13 точковых мутаций в промоторной области гена F9. Именно с такими мутациями связана Лейденовская (Leyden) форма заболевания, при которой к возрасту половозрелости наступает улучшение многих клинических показателей и, в частности, исчезает кровоточащий диатез. Объясняется это тем, что мугации в промоторной области могут приводить к переключению конститутивной экспрессии гена на стероид-гормонзависимую, нарушая связывание гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF-4), принадлежащего к суперсемейству транскрипционных факторов для рецепторов стероидных гормонов.

Гемофилия В

 

Гемофилия В - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора IX - важного компонента средней фазы внутреннего каскада свертывания крови. Белок (фактор IX) - гликопро-теин - состоит из 415 аминокислотных остатков, объединенных в 8 доменов, синтезируется в виде молекулы-предшественника клетками печени. В плазме крови фактор IX находится в виде гетеродимера, состоящего из двух полипептидных цепей - легкой (L) и тяжелой (Н), ко-валентно связанных между собой одним дисульфидным мостиком. Фактор IX циркулирует в виде неактивного зимогена до тех пор, пока не произойдет протеолитическое высвобождение его активирующего пептида, что позволяет ему принять конформацию активной сериновой протеазы. Его роль в свертывании крови связана с активацией фактора X посредством взаимодействий с ионами кальция, фосфолипидами мембраны и фактором VIII.

Ген фактора IX транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 1383 п.о. [Kurachi et al., 1982; Jagadeeswaran et al., 1984; Green et al., 1991; Giarmelli et al., 1993]. Для гена F9 характерна высокая частота возникновения мутаций -4,1-10 за поколение. Так же как и при гемофилии А, мутации значительно чаще возникают в сперматогенезе, чем в оогенезе [Montandon A.J. et al., 1992]. Считается, что вероятность получения мутации от отца в 11 раз выше, чем от матери. Это означает, что в изолированном случае вероятность гетерозиготного носительства мутации у матери составляет более 80%. Обнаружена четкая корреляция между возрастом отца и вероятностью получения от него новой мутации в гене F9. Так, средний возраст отца в момент рождения дочери - носительницы новой мутации, составляет около 42 лет [King S.etal., 1992].

Генно-инженерные подходы в терапии

Учитывая наличие функционально активной формы белка фактора VIII в плазме крови, генно-инженерные подходы в терапии этого заболевания направлены на получение в чистом виде полноценного белкового продукта (заместительная терапия) либо на введение в организм больного соответствующей кДНК, обеспечивающей синтез фактора VIII и его поступление в кровь. Осуществленное 10 лет назад выделение и клонирование кДНК этого гена сделало реальным оба эти подхода. Имеются сообщения о получении трансгенных животных (коз), в геном которых введен ген фактора VIII. Они могут быть использованы как продуценты полноценного белкового продукта. Генная терапия этого заболевания находится на стадии экспериментальных разработок (см. главу 9). Успешно осуществлена трансдукция фибробластов человека in vitro с помощью ретровирусного вектора. Основная проблема в данном направлении заключается в выборе эффективного промотора и подборе клеток, в которых экспрессия гена могла быть достаточно длительной. В настоящее время найдены невирусные промоторы, обеспечивающие эффективную и длительную экспрессию гена фактора VIII in vivo. В качестве возможных клеток-мишеней используют мышечные клетки, фибробласты, гепатоциты и клетки эндотелия сосудов. В 1994 г. методом направленного мутагенеза (см. главу 8) получены трансгенные модели гемофилии А на мышах. Есть все основания считать, что клинические испытания генокоррекции этого заболевания начнутся уже в ближайшем будущем.

Инверсии и точечные мутации в гене F8

Помимо инверсий и точечных мутаций в гене F8 зарегистрированы несколько случаев инсерционного мутагенеза, связанных с перемещением в геноме транспозоноподобных элементов типа LINE (см. главу 2). У двух пациентов неродственного происхождения был идентифицирован инсертированный в экзоне 14 F8C-reHa длинный элемент LINE-1 (L1) [Kazazian H.H. et al., 1988]. В обеих семьях это были мутации de novo. L1 последовательности представляют собой специфическое для генома человека семейство длинных, размером от 2 до 4 тыс. п.о., повторяющихся элементов, распределенных по всем хромосомам и состоящее примерно из 100000 копий. Было показано, что оба L1 элемента, инсертированные в F8C-reH, родственны ретротранспозону, локализованному на хромосоме 22 [Dombroski B.A. et al., 1991]. В третьей семье инсертированный в интроне 10 F8C-reHa L1 элемент не был связан с болезнью. Все 3 L1 элемента имели открытые рамки считывания, а соответствующие реконструируемые аминокислотные последовательности были высоко идентичны друг другу с уровнем гомологии, превышающим 98%. Таким образом, было получено еще одно косвенное подтверждение существования ряда функциональных L1 элементов, кодирующих один или несколько белков, необходимых для их рет-ротранспозиции.

Прямая диагностика протяженных инверсий в гене F8 осуществляется путем блот-гибридизации с ДНК-зондом р482.6 с последующей рестрикцией эндонуклеазами Bell, Dral, Ncol [Lakich D. et al., 1993]. В остальных случаях в силу отсутствия мажорных мутаций в гене F8C чаще всего используют косвенные методы молекулярной диагностики. С помощью ПЦР анализируют полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, Hindlll полиморфизм в интроне 19, Hbal полиморфизм в интроне 22 и внегенный полиморфизм локуса DXS52 (Stl4/Taql) [Асеев М. и др., 1989; Сурин В. и др., 1990; Aseev M. et al., 1994].

Во время процессинга первичного белкового продукта

Во время процессинга первичного белкового продукта гена F8C от исходного пептида из 2351 аминокислотного остатка отщепляется последовательность в 335 аминокислотных остатков. В плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с гемофилией А не имеют фактора VIII, 5% -имеют нормальное количество нефункционирующего белка, и в остальных случаях активность белка сохранена, но его количество резко снижено [McGinnis M.J. et al., 1993]. Изолированные случаи гемофилии А составляют 30%, 70% - семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе [Rosendaal F.R. et al., 1990; Brocker-Vriends A.H.J.T. et al., 1991]. Это означает, что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителями мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации, могут быть соматическими или гонадными мозаиками, так что вероятность повторного рождения больного ребенка у них также повышена.

Около 10% всех идентифицированных мутаций в гене F8 являются делениями одного или нескольких смежных экзонов. Примерно 5% всех мутаций составляют короткие делеции и дупликации гена, остальные мутации - точковые замены [Antonarakis S.E. et al, 1995]. Почти половина миссенс-мутаций идентифицированы в домене А2. Показано, что 35% всех известных мутаций локализованы в CpG-динуклеотидах, причем свыше 90% из них представляют собой С-Т- или G-A-транзиции [Cooper D.N., Youssoufian H., 1988]. Подобные мутации в кодирующих районах встречаются в 42 раза чаще, чем это можно было бы ожидать на основании случайного характера мутагенеза. Для подавляющего большинства мутаций гена F8C характерно практически полное отсутствие «горячих» точек: каждая семья высокого риска по гемофилии А имеет свою собственную мутацию. Исключение составляет группа обнаруженных сравнительно недавно протяженных инверсий интрона 22, захватывающих эк-зоны 1-22 и полностью блокирующих функцию гена. Такие инверсии, как оказалось, присутствуют в 45% семей с тяжелой формой гемофилии A [Lakich D. et al., 1993]. Причиной инверсий в этой области гена является гомологичная рекомбинация между идентичными последовательностями гена F8A, расположенного в интроне 22 F8C-reHa, и другими копиями этого же гена, находящимися иа расстоянии 500 тыс. п.о. от 5'-конца гена F8

Гемофилия А

 

Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в системе свертывания крови (см. табл. 10.4). Комплекс фактора VIII с относительной молекулярной массой более 1 млн дальтон состоит из двух компонентов. Главный компонент - VIIIC, кодируется геном F8C, локализованным в Х-хромосоме. С VIIIC нековалентно связан фактор Виллебранда -VI1IR, кодирующийся аутосомным геном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регулирует его активность.

Ген F8C - один из очень крупных генов человека; содержит 26 экзонов размером от 69 до 3106 нуклеотидов [Wood et al., 1984; Toole et al., 1984; Higuchi et al., 1991; Naylor et al., 1993]. Общая длина интронов составляет 177 тыс. п.о.; около 20% этой ДНК приходится на интрон 22 (32,4 тыс. п.о.). мРНК гена F8C размером 9009 нуклеотидов включает 5'-нетранслируемую последовательность (150 п.о.), З'-нетранслируе-мую последовательность (1806 п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в интроне 22 локализованы еще два других структурных гена неизвестной природы - F8A и F8B, что было обнаружено молекулярными методами. Ген F8A, целиком локализованный в интроне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый экзон гена F8B также расположен в интроне 22, а следующие его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена экспрессируются во всех тканях [Levinson В. et al.,1990; Freije D., Schlessinger D., 1992; Lakich D. et al., 1993]. Интрон 22 оказался не обычным и в том отношении, что содержит CpG-островок на расстоянии около 10 тыс. п.о. от экзона 22 — предположительного места локализации бинаправленного промотора для генов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 тыс. п.о. в 5'-направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые копии гена F8A [Lakich D. et al., 1993].

модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна

Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна - mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации, спонтанно возникшей в C57BL/10 линии [Bulfield G. et al., 1984]. В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофии полностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клинических аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована нонсенс-мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаружена также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзона 7 DMD-гена у собак [Sharp N.J.H. et al., 1992].

В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципиальная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генно-инженерных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистрофина (14 тыс. п.о.) или его делетированную, но функционально активную форму, так называемый мини-ген (6,3 тыс. п.о.) [Wells D.J. et al., 1992; Cox G.A. et al., 1993; Acsadi G. et al., 1995]. После внутривенного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинантного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных [Srataford-Perricaudet L.D. et al., 1992]. Несмотря на эти очевидные у:пехи, проблема генно-инженерной коррекции МД еще далека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии МД по сравнению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных миобластов). Пока не утверждена ни одна программа клинических испытаний генотерапевтическо-го подхода к МД (см. главу 9). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходимость обеспечения системы эффективной доставки гена дистрофина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно важно, - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995 г. Исследования по генотерапии МД начаты в рамках программы «Геном человека» и в нашей стране.

Для диагностики гетерозиготного носительства

Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медико-генетического консультирования представляют случаи так называемого гонадного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов) половых клеток (ооцитов) с мутант-ным и нормальным генами дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возникать еще на уровне первичных половых клеток, т. е. на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам, примерно 6 - 7% всех спорадических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного МД не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спорадического случая рождения ребенка с МД и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% [Essen A.J. et al., 1992].

У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохими-ческом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистрофин положительные волокна. Однако при использовании антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит, и это позволяет отвергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероятный механизм такого явления - возникновение второй соматической делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки считывания, вызванный основной делецией. В результате мутантный ген может транскрибироваться с образованием стабильного, хотя и аномального дистрофина [Klein C.J. etal., 1992].

Различия между формами Дюшенна и Беккера

Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и протяженностью делеций не отмечается, но различия между формами Дю-шенна и Беккера в общем случае связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина может быть вовлечен также в другие структурные перестройки - дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена дистрофина составляют дупликации и около 35% - точечные мутации, преимущественно микроделеции (от одного до нескольких нуклеотидов), а также нонсенс-мутации. Относительно высокий процент нонсенс-мутаций в гене дистрофина связывают с присутствием большого количества глутаминовых триплетов, мутации в которых часто приводят к образованию стоп-кодона. Крайне редки мис-сенс-мутации. Считается, что в 30% семей с МД и МБ - мутации спонтанного происхождения и возникают преимущественно в оогенезе, а в остальных семьях - это наследственные формы.

Разработаны очень эффективные методы диагностики делеций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновременное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех крупных делеций гена [Baranov V.S. et al., 1993]. Для обнаружения гетерозиготного носительства делеций используется метод RT PCR, т. е. изоляция эктопической DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амплификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование [Roberts R.G. et al., 1991; Roberts R.G. et al., 1992 a, b]. Для этой же цели применяется метод иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на гистологических срезах биоптатов мышц [Arahata et al., 1989]. При отсутствии идентифицируемой делеций применяют косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутригенных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taql, pERT87-15/BamHl, pl24/Pstl, 16intron/Taql и аллельных вариантов динуклео-тидных СА-повторов в интронах 49 и 50 - STR-49, STR-50 [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987; Евграфов О.В. и др., 1991; Малышева О.В. и др., 1991].

В 60% случаев в гене DMD

В 60% случаев в гене DMD у больных мальчиков обнаруживаются протяженные делении, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточенные обычно в двух «горячих» районах - в области 5'-конца гена (экзоны 6-19) и в З'-конце (экзоны 40-53), при этом 30% делеций локализованы в проксимальной части гена и 70% - в дистальной. Проксимальные делеций возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать «семейными» мутациями. Дистальные делеций возникают позднее и чаще встречаются как изолированные случаи. Считается, что в спорадических случаях повторный риск рождения больного ребенка при проксимальной делеций составляет 30%, тогда как при дистальной - только 4% [Passos-Bueno M.R. et al., 1992].

Отмечены популяционные особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях, а также в популяциях России и стран СНГ [Baranov V.S. et al., 1993]. У некоторых пациентов делегирован не только весь ген, но и достаточно протяженные соседние области. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части дистрофинового гена. Так, в интроне 44 протяженностью 160-180 тыс. п.о., расположены около 30% точек разрыва всех делеций. Показано, что проксимальный конец одной из делеций в интроне 43 расположен внутри транспозоно-подобного элемента, принадлежащего ТНЕ-1 семейству ретротранспо-зонов [Pizzuti A. et al., 1992]. Описан еще один пациент, у которого деления оканчивается в ТНЕ-1-элементе. Эти элементы размером 2,3 тыс. п.о., фланкированные 350-нуклеотидными длинными терминальными повторами (LTR), повторены около 10000 раз в геноме человека. Гипотеза нестабильности DMD-гена, вызванная присутствием транспозоно-подобного элемента, привлекается также для объяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, принадлежащих одной и той же родословной, т. е. имеющих мутацию общего происхождения [Miciak A. et al., 1992]. В двух случаях дупликаций из восьми, для которых было проведено секвенирование концевых участков, показано присутствие Alu-элементов. В остальных шести случаях рекомбинация осуществлялась между негомологичными последовательностями [Ни X., Worton R.G., 1992].

Миодистрофия Дюшеииа

 

Миодистрофия Дюшенна - сцепленная с полом мышечная дистрофия; выделяют две клинические формы: тяжелую - миодистрофию Дюшенна (МД) и гораздо более мягкую - миодистрофию Беккера (МБ). Ген миодистрофии Дюшенна (DMD) - один из самых крупных известных генов человека, кодирует белок дистрофии, входящий в состав сарколеммы мышечного волокна. При МД дистрофии либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. При форме Беккера, как правило, дистрофии присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном состоянии. Ген миодистрофии Дюшенна также был идентифицирован методами позиционного клонирования [Kunkel L.N. et al., 1985;KoenigM. etal., 1988].

В соответствии с современными представлениями [Ahn A.H., Kunkel L.N., 1993], огромный DMD-ген находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга. По крайней мере пять независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию первых экзонов в разных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. Три промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как два - осуществляют экспрессию последних доменов взаимоисключающим способом. Высококонсервативные последовательности шести экзонов, кодирующих С-конец белка, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающихся форм дистрофина, осуществляющих различные функции. Так, идентифицирована 6,5 тыс. п.о. мРНК, транскрибируемая с DMD-гена и являющаяся, по-видимому, его основным продуктом в немышечных тканях, включая мозг [Bar S. et al., 1990]. Соответствующий белок значительно отличается от дистрофина, и его уровень в некоторых немышечных тканях сопоставим с количеством дистрофина в мышцах. Описан также 4,8 тыс. п.о. транскрипт того же локуса, экс-прессирующийся во многих типах тканей, но особенно в Шванновских клетках проводящей нервной системы, где сам дистрофии отсутствует [Blake D.J. et al., 1992]. Этот белок получил название аподистрофин-1. Клонирован и секвенирован еще один 2,2 тыс. п.о. транскрипт DMD-гена, кодирующий аподистрофин-3, экспрессирующийся в позднем эмбриогенезе [Tinsley J.M. et al., 1993].

65% больных муковисцидозом

В настоящее время в России доступны идентификации по наличию известных мутаций около 65% больных муковисцидозом [Иващенко Т.Э., 1992; Потапова О.Ю., 1994]. Диагностическая ценность основных мажорных мутаций в порядке убывания их частоты следующая: delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%), 394delTT (2,1%); G542X (2,0%) [Иващенко Т.Э., 1992]. Согласно нашим данным [Баранов B.C., 1994], молекулярная диагностика муковисцидоза прямыми методами возможна примерно в 55 - 60% семей. В случае непрямой диагностики используются полиморфные сайты локусов ДНК, расположенные в непосредственной близости (IRP, D7S8, D7S23, МЕТ) или внутри самого гена CFTR - минисателлитные последовательности в интронах 6, 8, 17Ь гена CFTR [Агбангла К. и др., 1992; Chebab F.F. et al., 1991; Morral N. et al., 1991; Zielenski J. et al., 1991; Potapova O. et al., 1994]. При отсутствии мажорных мутаций и информативности по полиморфным сайтам молекулярные исследования могут быть дополнены биохимическим анализом амниотической жидкости на содержание ферментов микроворсинок кишечника плода [Горбунова В.Н. и др., 1989; Баранов B.C. и др., 1991].

Методами направленного мутагенеза (gene targeting) (см. главу 8) в различных лабораториях США и Великобритании осуществлено успешное конструирование трансгенных моделей муковисцидоза на мышах [Clarke L.L., et al., 1992; Colledge W.H. et al., 1992; Dorin J.R. et al., 1992; Snouwaert J.M. et al., 1993]. Выяснены признаки сходства и некоторые межвидовые различия проявления мутации гена CFTR у мышей и человека. Показано, что различные мутации этого гена по-разному реализуются в фенотипе CFTR-дефицитных мышей. Так, в одной из трансгенных линий отмечено преимущественное поражение легких, у других -поджелудочной железы и кишечника. В одной мутантной линии наблюдается гибель большого числа зародышей от причин,.сходных с мекони-альным илеусом. Таким образом, эти линии представляют собой идеальные модели для исследования молекулярных основ патогенеза муковисцидоза, а также для разработки и испытания терапевтических мероприятий, включая генотерапию. Как уже отмечалось в предыдущей главе, программы генотерапии муковисцидоза реализуются по крайней мере в 7 центрах США и двух центрах Западной Европы (Великобритании и Франции). Уже успешно осуществлены не только апробации генно-инженерных конструкций на мутантных культурах клеток и модельных животных, но начаты и успешно проводятся клинические испытания генотерапевтического лечения муковисцидоза на 70 пациентах. Исследования по генотерапии муковисцидоза, начатые в нашей стране, пока проводятся на уровне клеточных культур.

Биохимический анализ клеток пациентов,

Биохимический анализ клеток пациентов, больных муковисцидо-зом, позволил выяснить фенотипические особенности экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить определенный градиент патологических нарушений на мембранном, клеточном и организменном уровнях в зависимости от типа мутации, ее локализации и структуры аномального белкового продукта [Баранов B.C., Гинтер Е.К., 1995]. Так, было установлено, что некоторые CFTR-мутации, в том числе и delF508, не препятствуя трансляции, нарушают процессинг белка так, что последний не достигает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нарушениях [Sheppard D.N. et al., 1993]. Другие мутации (R117H, R334W и R347P), выявленные при более мягких формах заболевания, не затрагивают процессинга белка, хлорный канал формируется, но функционирует менее эффективно, чем в норме. Сопоставление процессинга, локализации и функционирования белка в трех линиях L-клеток, трансдуцированных нормальным CFTR-геном и двумя его аллельными вариантами, показало, что дефект, возникающий при одной из мажорных мутаций - G551D, связан с частичной инактивацией функции хлорного канала, в то время как delF508, как оказалось, обладает комбинированным эффектом - нарушает локализацию и стабильность белка и снижает эффективность его функционирования в качестве хлорного канала [Yang Y. et al., 1993]. Интересно, что мутация R117H в гомозиготном состоянии, чаще в компаунде с другими аллелями, в том числе с delF508, обнаруживается у пациентов с врожденным отсутствием семявыводящих канальцев (vas deferens). При этом клиника муковисцидоза у таких пациентов, как правило, отсутствует или очень стерта. Это еще один из примеров фенотипического разнообразия, обусловленного аллельными сериями.

Муковисцидоз

Некоторые из этих публикаций уже были упомянуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы в соответствующих подразделах этой главы. Следует также упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моногенными болезнями, которые были исследованы молекулярными методами в нашей стране и для которых в итоге были разработаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна мутаций оптимальные схемы молекулярного обследования семей высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства. Практически все эти исследования проводились в рамках основных научных программ ГКНТ «Геном человека» и «Приоритетные направления генетики». Обзор отечественных работ по молекулярной диагностике наследственных болезней представлен в ряде научных сводок [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1991; Баранов B.C., 1992; Баранов B.C., 1994; Баранов В. С. и др., 1994; BaranovV.S., 1993].

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - самое распространенное моногенное наследственное заболевание у представителей белой расы. Это первая «генная» болезнь, молекулярные основы которой определены методами позиционного клонирования без использования каких-либо данных о структурных перестройках в области локализации предполагаемого гена [Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989]. Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или крупными делениями, затрагивающими исследуемый ген, значительно облегчает его картирование и идентификацию, как это было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом грануломатозе. В области локализации гена муковисци-доза хромосомные перестройки практически отсутствуют. Подробно об истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следующих отечественных работах [Гембицкая Т.Е., Баранов B.C., 1991; Баранов B.C., ГинтерЕ.К., 1995].

Белковый продукт гена - трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза - ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных каналов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мембраны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от типа мутаций их локализации, функция гена ТРБМ при муковисцидозе может быть полностью или частично нарушенной.

К началу 1995 г. в гене ТРБМ идентифицированы более 500 мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распространенной у жителей Западной Европы и Северной Америки является мутация delF508, приводящая к отсутствию фенилаланина в 508-м положении белка ТРБМ. В этих странах частота delF508 находится в пределах 70 -85%. В Европе частота мутации обнаруживает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток, достигая 85% в Дании, она уменьшается до 50% в Италии и до 20 - 30% - в Турции. В Европейской части России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хромосом. У евреев-ашкенази доминирующей по частоте является мутация W1282X (33%).

МОНОГЕННЫЕ НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ, ДИАГНОСТИРУЕМЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕТОДАМИ В РОССИИ

 

Сводка, представленная составлена на основании анализа работ основных отечественных лабораторий и публикаций, связанных с проблемой молекулярной диагностики наследственных болезней. Сводка не является исчерпывающей и включает преимущественно те заболевания, для которых возможна или уже проводится диагностика на внутриутробных стадиях развития [Баранов B.C., 1994].

Моногенные болезнв, диагностируемые молекулярными методами и доступные пренатальной диагностике в России

№пп Болезни Медицинские центры

1 Муковисцидоз ИАГ, ИЭМ, РЦМГ, ТИМГ

2 Миодистрофия Дюшенна-Беккера ИАГ, РЦМГ, ТИМГ

3 Гемофилия А ИАГ,ГНЦ

4 Гемофилия В ИАГ, ГНЦ

5 Фенилкетонурия ИАГ, ГНЦ, ПМА, РЦМГ

6 Синдром ломкой Х-хромосомы ИАГ

7 Миотоническая дистрофия ИАГ

8 Болезнь Внллебранда ИАГ, ГНЦ

9 Хорея Гентингтона ИАГ, РЦМГ, НИИН

10 Болезнь Леш-Нихана ИАГ

И Спинально-бульбарная мышечная атрофия ИАГ, НИИН

12 Гепатолентикулярная дегенерация РЦМГ, ИАГ

13 Болезнь Хантера ИАГ

14 Адреногенитальиый синдром ЦОЗМиР, РЦМГ

15 Атаксия Фрндрейха ГНЦ

16 Р-Талассемия ГНЦ, ПМА

17 Болезнь Вердннга - Гоффмана РЦМГ

18 Дефицит альфа-1-антитрнпснна ИЭМ

19 Семейная гиперхолестеринемия ИЭМ, ПМА

20 Предрасположенность к инсулинзависимому диабету ПМА

21 Дефицит ацил-СоА дегидрогеназы ПМА

Примечание. ИАГ - Институт акушерства н гинекологии РАМН, Санкт-Петербург; ИЭМ - Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург; ПМА - Педиатрическая медицинская академия, Санкт-Петербург; РЦМГ - Российский центр медицинской генетики РАМН, Москва; ГНЦ - Гематологический научный центр МЗ РФ, Москва; ТИМГ - Томский институт медицинской генетики, Томск; НИИН - Научно-исследовательский инсгитут неврологии РАМН, Москва; ЦОЗМиР - Центр охраны здоровья матери и ребенка, Москва.

Отдельные аспекты, касающиеся идентификации соответствующих генов, их картирования, клонирования и сканирования мутаций уже упоминались в качестве примеров при изложении соответствующих вводных глав монографии. В этой части нам представляется целесообразным суммировать эти разрозненные сведения и охарактеризовать те наиболее частые, социально значимые моногенные заболевания, в отношении которых у нас накоплен достаточно большой собственный опыт молекулярных исследований.  Многим из приведенных  заболеваний посвящены обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие наряду с клиническими данными специальные разделы, посвященные молекулярной природе патологического процесса, характеристике гена, его мутаций, их фе-нотипических проявлений, а также последним достижениям и перспективам лечения, включая генную терапию.

БОЛЕЗНИ ЭКСПАНСИИ, ВЫЗВАННЫЕ «ДИНАМИЧЕСКИМИ» МУТАЦИЯМИ

 

Обнаруженный в 1991 г. новый тип так называемых динамических мутаций и связанные с ними наследственные заболевания частично рассматривались нами . Однако их уникальность, необычный механизм экспрессии, особенности наследования, быстрый рост нозологии, обусловленных подобными нарушениями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно широкая распространенность  делают целесообразным их более подробный анализ.

Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды и пр.). Суть мутации заключается в нарастании числа триплетных повторов, расположенных в регуляторнои или в кодирующей, а значит, и в транслируемой части генов. Впервые такой тип мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фрагильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача которой не подчинялась обычным менделевским законам [Hirst et al., 1991; Rousseau et al., 1991 ]. В дальнейшем аналогичные динамические мутации были описаны и при 7 других наследственных заболеваниях, контролируемых генами, расположенными на разных хромосомах [La Spada et al., 1991; Shelbourne et al., 1992; Huntington's Dis. Collab.Res.Group, 1993; Chung et al., 1993; Orr et al., 1993; Kawaguchi et al., 1994; Knight R.A. et al., 1994; Koide et al., 1994; Nagafuchi et al., 1994; Wieringa, 1994]. Вместе с тем все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих признаков, позволяющих объединить их в одну самостоятельную группу. Прежде всего для триплетных повторов, экспансия которых блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от единиц до нескольких десятков. Другой их особенностью является доминантный тип наследования, характерный как для X-сцепленных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Особенностью практически всех болезней «экспансии» является также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключается в нарастании тяжести симптомов заболевания в последующих поколениях, что, как оказалось, является результатом дальнейшего увеличения («экспансии») числа триплетов после того, как их количество превысило нормальное. Характерными для этих нозологии являются и особенности их передачи потомству: для некоторых заболеваний типична передача по материнской (FraX, миотоническая дистрофия), а для других - преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона). Практически для всех «динамических» мутаций характерно поражение головного мозга и особенно подкорковых структур, причем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет предполагать определенное сходство механизма экспансии триплетов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе, затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов, при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомологичного триплета, в норме разделяющего цепочку монотонных повторов. Вместе с тем патогенетические механизмы проявления мутаций экспансии принципиально различны. В случае различных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии соответствующих генов вследствие стабильного метилирования области CpG-островка в промоторной части генов. При миотонической дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому, связано с ошибками взаимодействия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосомами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболеваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная атрофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако образующийся белковый продукт с необычно длинной поли-глутаминовой цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального метаболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга.

Таким образом, причиной повреждающего действия одних «динамических» мутаций является блок генной экспрессии, т. е. потеря функции (loss-of-fiinction mutation), тогда как другие мутации того же типа, связанные с нейродегенеративными заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с аномальными функциями (мутации типа gain-of-function). Интересно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число которых крайне невелико. Для каждой болезни «экспансии» разработан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Амплификация области триплетньгх повторов и дальнейший электрофоретический анализ синтезированных продуктов позволяет определить число повторов, т. е. провести генотипирование аллелей. Вместе с тем при числе повторов более двухсот амплификация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях размеры участка повторов определяют методом блот-гибридизации с соответствующими ДНК-зондами. Например, используют зонды StB12.3, Oxl.9 или ОхО.55 в случае синдрома FRAXA; зонд cDNA25 - в случае миотонической дистрофии.

Подробней с этой интересной группой заболеваний можно ознакомиться в ряде обзоров [Баранов B.C. и др., 1994; Иллариошкин С.Н. и др., 1995; Willems P.J., 1994].

успешный ретровирусный перенос

Так, в опытах in vitro был осуществлен успешный ретрови-русный перенос нормальной кДНК гена GBA в культурах мутантных фибробластов [Sorge J. et al., 1987] и в культурах клеток крови пациентов с болезнью Гоше [Fink J.K. et al., 1990], в результате чего была достигнута коррекция глюкоцереброзидазной активности. Такая же коррекция метаболических дефектов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была достигнута путем введения в соответствующие му-тантные линии клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS, соответственно. При этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретрови-русной трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной, и рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глюкозоа-миногликанов. Генокоррекция первичного биохимического дефекта при мукополисахаридозе VII - синдром Слая [Guise K.S. et al., 1985; Oshima A. et al., 1987; Miller R.D. et al., 1990; Tomatsu et al.,1991] - была получена как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок (бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появлялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических глюкозоаминогликанов [Wolf J.H. et al., 1992]. Введение этого же гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосомного накопления в печени и мозге и частичной коррекции болезни у трансгенных животных [Wolf J.H. et al., 1992]. В другом эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имплантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблюдали экспрессию введенного гена и полное исчезновение лизосомных отложений в печени и в мозге [Sly W.S., 1993]. Полученные результаты подтверждают принципиальную возможность лечения по крайней мере некоторых лизосомных болезней с помощью методов генной терапии.

В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу

В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фенотип. К примеру, при некоторых формах метахроматической лейкодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания связана с существованием так называемого псевдодефицитного аллеля ARSA-гена [Stein et al., 1989; Polten et al., 1991]. Этот полиморфный аллель встречается в популяциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы по нему составляют 1-2% всего населения. Оказалось, что псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух мутаций в цис-положении. Одна из них -З'-концевая регуляторная мутация в первом сайте после стоп-кодона -изменяет сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс-мутация в 6-м экзоне - приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно отметим, что для гена ARSA (так же как н для IDUA-гена) обнаружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фибробластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, размером 2,1 тыс. п.о. и 3,9 тыс. п.о., соответственно. У гомозигот по псевдодефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2,1 тыс. п.о. мРНК, при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается. Однако при наличии S96F-мутации в ARSA-гене на фоне псевдодефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.

Кратко рассмотрим состояние проблемы гено-коррекции лизосомных заболеваний. В литературе отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях программ генотерапевтиче-ского лечения этих заболеваний, однако по крайней мере для некоторых лизосомных болезней такие программы уже разработаны и утверждены. Имеются сведения о положительных результатах таких исследований на культурах мутантных клеток и на модельных животных.

Яркие примеры этнических различий

Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных болезней накопления, как болезнь Тея-Сакса [Proia R.L. et al., 1987; Myerowitz R. et al., 1988; Arpaia E. et al., 1988], Ниманна-Пика [Winsor E.J.T. et al., 1978; Quintern L.E. et al., 1989; Levran O. et al., 1991; Schuchman E.H. et al., 1992; Carstea E.D. et al., 1993; Kurimasa A. et al., 1993 ] и болезнь Гоше [Sorge J. et al., 1985; Sorge J. et al., 1987]. Прежде всего эти заболевания особенно распространены среди евреев-ашкенази, у которых они встречаются в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных мутаций для всех трех заболеваний у 70-95% всех пациентов еврейского происхождения скорее всего нельзя объяснить только эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное преимущество гетерозигот, характер миграции, социальные и религиозные особенности, обусловливающие ассортативность образования супружеских пар, - вот те факторы, которые, по всей видимости, лежат в основе этих различий. В этой связи интересно отметить, что среди пациентов других национальностей мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа В часто встречается среди жителей стран, расположенных в западной части Северной Африки. Однако в 80% случаев заболевание связано с делецией R608 в SMPDl-гене, которая не является мажорной среди евреев-ашкенази.

На примере лизосомных болезней могут быть хорошо прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, либо к синдрому Шейе. Разные миссенс-мутации в гене NAGA приводят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки [Wang A.M. et al., 1990]. Важное значение для анализа молекулярных основ патогенеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фенотипической манифестацией (так называемые взрослые формы). Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болезнях Тея-Сакса [Navon R. et al, 1989; Triggs-Raine B. L. et al., 1992] и галактосиалидозе [Takano Т. et al., 1991; Zhou X.Y. et al., 1991]. Очень интересен случай различного фенотипического проявления на разном расовом генетическом фоне одной и той же мутации - мажорной делении в 16 тыс. п.о., обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни Зандхоффа [Mclnnes В. et al.,1992; Sidransky E. et al., 1994]. В частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в компаунде с миссенс-мутацией P417L, описанной впервые в Японии у пациента с подростковой формой заболевания, проявлялась как взрослая форма с очень мягким течением заболевания.

синдром Гурлера

Для двух лизосомных болезней - фукозидоза [Fowler M.L. et al., 1986; Roychoudhuri A.K. et al., 1988; Kretz K.A. et al., 1992; Seo H.C. et al., 1993] и синдрома Гурлера [Moskowitz S.M. et al., 1993; Scott H.S. etal., 1993], мажорными являются нонсенс-мутации. Более того, при фуко-зидозе все известные к настоящему времени мутации приводят к полному отсутствию продукта FUCAl-гена. Так, наряду с мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у больных фукозидозом, описаны еще 4 нонсенс-мутации и 4 делеции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера 2 мажорные нонсенс-мутации - W402X и Q70X -составляют около 50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того, при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по частоте нонсенс-мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считывания. 3 миссенс-мутации и интронная мутация, создающая дополнительный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к полному блоку синтеза иду-ронидазы и реализуются в виде синдрома Шейе [Scott H.S. et al., 1991; Scott H.S. et al., 1992]. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурлера и синдром Шейе - являются классическим примером феноти-пического разнообразия, обусловленного существованием аллельных серий. Такой спектр крайне тяжелых мутаций нельзя объяснить только повышенной частотой их возникновения. Более вероятным представляется предположение о том, что кодируемые FUCA1- и lDUA-генами белки обнаруживают определенную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют функциональную активность при определенных аминокислотных заменах, т. е. миссенс-аллели в этих генах проявляют себя как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболеваний.

Хорошо известно, что распространение мутаций в популяциях определяется не только и не столько повышенной частотой их возникновения, но многими другими популяционно-генетическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом основателя. Типичным следствием эффекта основателя, как известно, является наличие различных мажорных по частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в частности, при ганглиозидозе GMI [Oshima A. et al., 1988; Noshimoto J. et al., 1991; Mosna G. et al., 1992; Suzuki Y. et. al., 1993]. Так, в Японии мажорными при этом заболевании являются миссенс-мутации 15 IT и R201C, тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффектом основателя можно объяснить высокую частоту болезни Краббе в Швеции [Zlotogora J. et al., 1990; Sakai N. et al., 1994] и аспартилглюкозаминурии в Финляндии [Ikonen E. et al., 1990; Ikonen E. et al., 1992]. В 98% случаев у пациентов финского происхождения заболевание обусловлено присутствием одной и той же миссенс-мутации C163S, резко уменьшающей активность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что эта мутация у больных находится в сильном неравновесном сцеплении с другой миссенс-мутацией в AGA-гене -R161Q, являющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Нельзя, однако, исключить возможность комбинированного влияния этих двух мутаций на фенотип.